攜帶供者抗原的第三方樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠皮膚移植耐受的研究.pdf

1、本課題擬從如下三方面研究抗原負(fù)載對(duì)低劑量粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)誘生的未成熟DC(GMlowDC)誘導(dǎo)免疫耐受能力的作用：1、我們觀察了GMlowDC對(duì)反復(fù)凍融法制備的氚標(biāo)記亮氨酸(3H-leucine，3H-Leu)標(biāo)記的異體抗原的攝取能力，并探索了抗原負(fù)載的時(shí)效關(guān)系，以驗(yàn)證通過該法制備攜帶異體抗原的第三方DC的可行性，為抗原

2、孵育的有效時(shí)間提供理論依據(jù)；2、我們觀察了GMlowDC負(fù)載抗原后其細(xì)胞表型和免疫功能的改變，并為致耐受性DC疫苗的制備做了有益的嘗試；3、我們觀察了攜帶供者抗原的第三方DC在小鼠異基因皮膚移植中的作用。通過上述工作，以期為今后臨床皮膚移植提供一套切實(shí)可行的方案。 研究?jī)?nèi)容 1.構(gòu)建小鼠骨髓源GMlowDC培養(yǎng)體系 用小鼠淋巴細(xì)胞分離液從小鼠骨髓細(xì)胞懸液中分離單個(gè)核細(xì)胞(Mononuclearcell，MNC)，

3、以貼壁去懸浮的方法去除粒細(xì)胞，在rmGM-CSF和rmIL-4(各1ng/m1)的作用下培養(yǎng)6天收集懸浮細(xì)胞即為GMlowDC。 2.GMlowDC抗原攝取能力的研究 以3H-Leu標(biāo)記C57BL/6小鼠處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MNC，用反復(fù)凍融法制備標(biāo)記后的抗原上清，觀察昆明小鼠GMlowDC攝取標(biāo)記抗原的情況，并與成熟DC比較。 3.GMlowDC負(fù)載抗原后免疫學(xué)性狀的改變 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了負(fù)載抗原前后G

4、MlowDC表面MHC-Ⅱ類分子和協(xié)同刺激分子表達(dá)情況的變化，觀察了其在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中誘導(dǎo)未致敏T淋巴細(xì)胞(naiveTlymphocytes)增殖的情況，并與未成熟DC和經(jīng)CTLA-4Ig修飾后的細(xì)胞進(jìn)行比較。 4.負(fù)載抗原的第三方DC對(duì)小鼠異基因移植皮片存活效果的影響 以C57BL/6小鼠為供者，BALB/c小鼠為受者，昆明小鼠為第三方，行同種異體皮膚移植。將40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、環(huán)磷酰胺

5、(Cyclophosphamide，CP)組(B組)、供者源未成熟DC組(C組)、第三方未成熟DC組(D組)、攜帶供者抗原的第三方DC組(E組)，每組8只。其中A、B組皮膚移植術(shù)前分別用生理鹽水或CP(200mg/kg)預(yù)處理，C、D、E組皮膚移植術(shù)前分別用CP(200mg/kg)和相應(yīng)DC懸液(1×107/只)預(yù)處理，并在術(shù)后第12天重復(fù)注射DC懸液(1×107/只)1次。記錄皮片存活情況并于術(shù)后第5、10天對(duì)皮片活檢，進(jìn)行組織學(xué)觀察

6、。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.3H-Leu標(biāo)記C57BL/6小鼠MNC情況 在加入rmGM-CSF(25ng/m1)培養(yǎng)2天后，倒置相差顯微鏡下見大量的細(xì)胞疏松地貼附于板壁上，呈簇狀生長(zhǎng)，形如葡萄串，表明細(xì)胞已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在加入3H-Leu繼續(xù)孵育24小時(shí)后，β液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)CPM均值為4508.2±674.4/105細(xì)胞，說明其蛋白合成代謝旺盛，3H-Leu已成功摻入到細(xì)胞內(nèi)。 2.GMlowDC攝取3H-Le

7、u標(biāo)記的異體抗原情況 成熟DC與抗原共孵育90min后，其CPM值為135.4±38.4/105細(xì)胞，延長(zhǎng)孵育時(shí)間至4h，CPM值為135.7±32.8/105細(xì)胞，表明進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記抗原較少，其攝取抗原的能力低下；而GMlOwDC組各時(shí)相點(diǎn)CPM值均明顯高于成熟DC組(P＜0.01)，說明GMlowDC具有較強(qiáng)的抗原攝取能力，且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，GMlowDC攝取抗原的量漸增，表現(xiàn)在CPM值隨時(shí)間而升高，并在1h左右達(dá)到高

8、峰。 3.負(fù)載抗原后GMlowDC細(xì)胞表型的改變 與負(fù)載抗原前比較，GMlowDC表面IA/IE的表達(dá)率(32.2±8.1％vs53.9±10.1％，P＜0.05)和CD80的表達(dá)率(24.7±9.5％vs71.3±18.3％，P＜0.01)均有明顯升高，說明GMlowDC在攝取抗原后，其細(xì)胞表面MHC-Ⅱ類分子和協(xié)同刺激分子己上調(diào)，細(xì)胞在表型上漸趨成熟。 4.負(fù)載抗原對(duì)GMlowDC細(xì)胞功能的影響 與對(duì)

9、照組相比，GMlowDC負(fù)載抗原后，其CPM值明顯升高(P＜0.01)，刺激指數(shù)(SI)為7.5＞2；而應(yīng)用CTLA-4Ig封閉細(xì)胞表面上調(diào)的協(xié)同刺激分子后，其CPM值與對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05)，SI為0.9＜2。 5.各組小鼠移植皮片存活時(shí)間比較 皮膚移植術(shù)后15天，A、B組皮片逐漸干燥成痂或壞死脫落，C、D、E組皮片色澤紅潤(rùn)、質(zhì)地柔軟。術(shù)后25天D組皮片也逐漸干燥成痂或壞死脫落，而C組與E組皮片存活良好。與A

10、組相比，C、D、E組皮膚移植物的MST均明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)，而B組MST與A組相比無顯著性差異(P＞0.05)，說明單純使用CP對(duì)移植皮片的存活無明顯影響，但與未成熟DC聯(lián)合應(yīng)用后可顯著延長(zhǎng)皮片的存活時(shí)間。同時(shí)，E組MST較D組顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)，而與C組差異不明顯(P＞0.05)，顯示第三方未成熟DC在與供者抗原及CTLA-4Ig孵育后，其誘導(dǎo)免疫耐受的能力較孵育前明顯提高，與供者源未成熟DC相近。 6.皮膚移植術(shù)

11、后第5天和第10天皮片組織活檢情況 組織切片顯示皮膚組織結(jié)構(gòu)較清楚，纖維組織排列有序，成纖維細(xì)胞多，真皮層內(nèi)血管腔豐富，結(jié)構(gòu)完整，大小不一，局部有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。表明皮片生長(zhǎng)情況良好，白細(xì)胞的趨化功能正常。 結(jié)論 1.實(shí)驗(yàn)成功建立了小鼠骨髓源未成熟DC的培養(yǎng)體系，骨髓源的MNC在低劑量GM-CSF和IL-4的作用下可擴(kuò)增出一定數(shù)量的未成熟DC。 2.GMlowDC不僅在免疫表型和細(xì)胞功能上與未成熟DC保持一

12、致，而且也具有較強(qiáng)的抗原攝取能力，可以有效地俘獲反復(fù)凍融法制備的抗原上清。 3.GMlowDC攝取抗原后，其表面MHC-Ⅱ類分子和協(xié)同刺激分子表達(dá)上調(diào)，同時(shí)也獲得了較強(qiáng)的刺激未致敏T淋巴細(xì)胞增殖的能力，說明其已趨于成熟。 4.應(yīng)用CTLA-4Ig封閉GMlowDC表面上調(diào)的B7分子，阻斷抗原呈遞的第二信號(hào)，可以建立抗原特異性免疫耐受。 5.經(jīng)CTLA-4Ig修飾的負(fù)載供體抗原的第三方DC與供者源未成熟DC一樣可以