第三方未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞負(fù)載同種異體抗原誘導(dǎo)免疫耐受的研究.pdf

1、建立針對(duì)供者抗原的特異性免疫耐受，是解決在同種異體皮膚移植中排斥反應(yīng)的理想途徑。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presentingcell，APC)，在抗原遞呈過(guò)程中，若共刺激分子(如CD80、CD86等)缺乏或被阻止，不能激活T淋巴細(xì)胞，反而誘導(dǎo)對(duì)該抗原的耐受，因此缺乏刺激分子表達(dá)的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immaturedendriticcell，imDC)具有先天的免疫耐受性

2、，能夠明顯地誘導(dǎo)移植免疫耐受。 供者源imDC與皮膚聯(lián)合移植能夠明顯延長(zhǎng)異體皮存活時(shí)間，并且療效肯定。結(jié)合目前燒傷外科臨床情況，大面積深度特重度燒傷病人一般利用同種異體皮移植覆蓋創(chuàng)面或行自體微粒皮+大張同種異體皮移植術(shù)，異體皮存活時(shí)間對(duì)穩(wěn)定病情及微粒皮存活有很大影響。若加上供者imDC聯(lián)合移植，可能會(huì)收到更好的效果，從而解決重度燒傷病人創(chuàng)面封閉難的問(wèn)題。目前臨床上供者皮膚主要來(lái)自死后捐贈(zèng)者，但可以利用的imDC主要來(lái)自平時(shí)健康成

3、人獻(xiàn)血或骨髓，從中分離培養(yǎng)并備存，因此臨床上可以利用的供者DC與皮膚并非來(lái)自同一個(gè)體，即稱(chēng)為“第三方模式”，由于第三方imDC不攜帶皮膚供者抗原，聯(lián)合皮膚移植后，要發(fā)揮誘導(dǎo)免疫耐受的作用必須首先攝取、加工處理及遞呈供者抗原，這樣就使它的作用受到影響，很難直接產(chǎn)生針對(duì)移植皮膚的免疫耐受。因此我們需要改造第三方imDC，使其攜帶并表達(dá)異體皮供者抗原，才可能誘導(dǎo)該抗原特異性的免疫耐受。 imDC具有強(qiáng)大的抗原攝取能力，imDC能攝取并

4、負(fù)載外來(lái)抗原已得到廣泛認(rèn)識(shí)，負(fù)載了細(xì)胞性抗原(如：吞噬凋亡細(xì)胞)的imDC能夠誘導(dǎo)該抗原特異性外周性免疫耐受，而且imDC有可能讓機(jī)體已經(jīng)產(chǎn)生的效應(yīng)性T細(xì)胞功能障礙。如果能通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將供者的主要組織相容性抗原基因轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞，將明顯誘導(dǎo)供者抗原特異性的免疫耐受，但是人的HLA基因復(fù)合體很大，約有幾千個(gè)kb，具有高度多形性，等位基因類(lèi)型多復(fù)雜，難以轉(zhuǎn)染成功，部分等位基因轉(zhuǎn)染又不能充分有效表達(dá)供者抗原。因此我們借鑒腫瘤免疫治療中，用

5、腫瘤細(xì)胞裂解物沖擊DC方法，將同種異體淋巴細(xì)胞于液氮和37℃水浴中反復(fù)凍融，制得淋巴細(xì)胞裂解物，其中包括了比較完整供者細(xì)胞抗原，與imDC共同孵育，imDC吞噬處理裂解物抗原后，變得成熟并誘發(fā)免疫反應(yīng)，說(shuō)明imDC成功負(fù)載了供者抗原，從而可以解決臨床上可以利用的供者皮源與供者DC不為同一個(gè)體的矛盾。 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)-4Ig是一種可溶性融合蛋白，它包含了CTLA-4的細(xì)胞外部分以及免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)(F

6、c片段)，在免疫反應(yīng)中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，是一種DC激活T細(xì)胞的共刺激分子阻滯劑。外源性給予的CTLA-4Ig通過(guò)與DC細(xì)胞的B7分子結(jié)合，阻斷了正常的DC與T細(xì)胞的共刺激途徑，即阻斷了第二信號(hào)刺激通路，從而誘導(dǎo)免疫耐受。全身運(yùn)用CTLA-4Ig可以抑制排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間，但這與運(yùn)用其它免疫抑制物類(lèi)似，為非特異性，影響整個(gè)機(jī)體的免疫能力，容易誘發(fā)感染及腫瘤。本實(shí)驗(yàn)中，將培養(yǎng)的第三方imDC與同種異體淋巴細(xì)胞抗原共同孵育后，再加以C

7、TLA-4Ig致耐處理，負(fù)載抗原的第三方imDC，能夠明顯抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，說(shuō)明CTLA-4Ig有效阻斷了協(xié)同刺激通路，并且避免了非特異性誘導(dǎo)免疫耐受的不足。可以預(yù)料，制備負(fù)載供者抗原并具有耐受性的第三方DC將能誘導(dǎo)抗原特異性的免疫耐受。 本實(shí)驗(yàn)將第三方imDC與供者抗原共同孵育，觀察DC免疫表型和功能的改變，并利用共刺激分子阻斷劑CTLA-4Ig進(jìn)行致耐處理后，觀察對(duì)其免疫功能的影響，為同種異體移植中誘導(dǎo)特異性免疫耐受的研

8、究奠定基礎(chǔ)。 本研究分兩部分進(jìn)行：1.人臍帶血imDC的體外擴(kuò)增及鑒定；2.DC負(fù)載同種異體抗原前后免疫表型和功能的變化。 主要結(jié)果： 1.倒置相差顯微鏡下觀察，在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞增殖明顯，逐步形成懸浮的形體較大并且不規(guī)則的細(xì)胞，表面可見(jiàn)大量的毛刺和突起，同時(shí)可見(jiàn)貼壁的巨噬細(xì)胞向四周伸展生長(zhǎng)；熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞膜表面染有綠色熒光，有明顯的突起和毛刺；電鏡下見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙，有大量層疊狀皺褶和突起。

9、 2.免疫表型檢測(cè)：imDC陽(yáng)性表達(dá)CDla、HLA-DR，低表達(dá)成熟標(biāo)志CD83及共刺激分子CD80、CD86，為imDC免疫表型；負(fù)載同種異體抗原的第三方DC，其表面標(biāo)志表達(dá)明顯增高，高表達(dá)CDla、HLA-DR、CD83、CD80及CD86，為mDC的免疫表型。 3.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，imDC不能刺激同種異體未致敏T淋巴細(xì)胞的增殖，成熟DC及抗原負(fù)載的DC明顯刺激T細(xì)胞增殖。 4.負(fù)載同種異體抗原的第三方DC

10、經(jīng)CTLA-4Ig致耐處理后，明顯抑制同種異體未致敏T淋巴細(xì)胞的增殖，其刺激指數(shù)為0.35。 主要結(jié)論： 1.人臍帶血源單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)rhGM-SCF+rhIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)分化后獲得的細(xì)胞，從細(xì)胞形態(tài)、免疫表型及功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定為imDC，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)建立的獲得imDC的方法是切實(shí)可行的。 2.第三方imDC經(jīng)過(guò)同種異體抗原負(fù)載后表現(xiàn)為成熟特性，細(xì)胞表型的成熟標(biāo)志及刺激分子表達(dá)明顯增高，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)提示：明顯刺激