腺病毒介導(dǎo)OX40Ig基因轉(zhuǎn)移在誘導(dǎo)大鼠肝臟移植物長(zhǎng)期存活中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的: (1)改良二袖套法大鼠原位肝臟移植動(dòng)物模型的成功建立。 (2)改良二袖套法大鼠原位肝臟移植急性排斥動(dòng)物模型的建立。 (3)重組腺病毒pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-OX40Ig(AdOX40Ig)的構(gòu)建 (4)研究重組腺病毒AdOX40Ig不同感染劑量對(duì)人肝細(xì)胞HL-7702生長(zhǎng)的影響及其感染效率，篩選最佳感染劑量進(jìn)行該重組腺病毒的生物學(xué)功能研究。 (5)探討腺病毒介導(dǎo)OX4

2、0Ig基因轉(zhuǎn)移在誘導(dǎo)大鼠肝臟移植物長(zhǎng)期存活中的作用和機(jī)制。 方法: (1)通過(guò)改良的雙袖套法對(duì)130對(duì)SD大鼠進(jìn)行了原位肝移植。前面40對(duì)為預(yù)試驗(yàn)組，中間60對(duì)為實(shí)驗(yàn)熟練組，后面30對(duì)為實(shí)驗(yàn)完善組。觀察各組的手術(shù)成功率和術(shù)后生存率以及手術(shù)并發(fā)癥。 (2)采用改良二袖套法行Lewis大鼠到Brown Norway(BN)大鼠原位肝臟移植共30例，將其隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組15例，術(shù)后未進(jìn)行特殊的干預(yù)，和對(duì)照組15例，術(shù)后1

3、～7天用FK5060.2mg/(kg.d)灌胃。術(shù)后4、7和10天的時(shí)間點(diǎn)上各組均隨機(jī)處死3只受體大鼠，收集血清與肝臟標(biāo)本，其余受體大鼠的血清標(biāo)本通過(guò)舌靜脈取血獲得。血清標(biāo)本檢測(cè)細(xì)胞因子和生化指標(biāo)，肝臟標(biāo)本觀察病理變化和肝細(xì)胞凋亡。每組各留6只觀察術(shù)后生存情況及生存時(shí)間。 (3)將經(jīng)過(guò)雙酶切的hOX40片段和hIgG1 Fc片段與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切的pAdTrack-CMV載體進(jìn)行連接反應(yīng)，并在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞里轉(zhuǎn)化成pAdTra

4、ck-CMV-hOX40Ig轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，再通過(guò)PCR擴(kuò)增雙酶切及DNA測(cè)序鑒定，經(jīng)鑒定正確的質(zhì)粒命名為pAdTrack-CMV-OX40Ig(pTOX40Ig)。 將pTOX40Ig轉(zhuǎn)移質(zhì)粒經(jīng)Pme I單酶切線性化后，與pAdeasy-1腺病毒載體氯化鈣法共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那平板，挑選克隆、擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒行PER及Pac I酶切鑒定。 鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX40Ig經(jīng)Pac I酶切后，采用Li

5、pofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染第3天在熒光顯微鏡下觀察熒光。重組腺病毒AdOX40Ig通過(guò)Western印跡鑒定。 (4)將AdvOX40Ig重組腺病毒以1、10、25、50、100、200MOI不同劑量感染HL-7702細(xì)胞。在普通光鏡視野下觀察被感染后HL-7702細(xì)胞形態(tài)，在熒光視野下觀察綠色熒光。 將AdvOX40Ig重組腺病毒和Ad空載體腺病毒以50MOI劑量分別感染爬片的HL

6、-7702細(xì)胞，用免疫熒光染色試劑盒進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)腺病毒介導(dǎo)的外源性O(shè)X40Ig基因在HL-7702細(xì)胞中的表達(dá)；用ELISA法測(cè)定轉(zhuǎn)染AdvOX40Ig的HL-7702肝細(xì)胞培養(yǎng)上清。 (5)改良二袖套法行Lewis大鼠到Brown Norway(BN)大鼠原位肝臟移植40例，隨機(jī)分成4組，每組10對(duì)。對(duì)照組：供、受體均未經(jīng)任何處理，空載病毒AdEGFP處理組：術(shù)中供肝離體后肝內(nèi)留存2ml的AdEGFP腺病毒[1×109

7、pfu/ml]，AdOX40Ig處理組：術(shù)中供肝離體后肝內(nèi)留存2ml的AdOX40Ig腺病毒[1×109pfu/ml]，F(xiàn)K506處理組：術(shù)后FK506(0.2mg·kg-1·d-1)灌胃。 術(shù)后第7天每組各處死BN鼠3只，先經(jīng)下腔靜脈抽血，取部分血清，進(jìn)行肝功能的檢測(cè)，取肝臟，觀察病理變化和肝細(xì)胞凋亡，取脾臟細(xì)胞與Lewis大鼠和第三品系F344大鼠的脾臟細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)。在BN大鼠與Lewis大鼠的ML

8、R反應(yīng)體系中，另取3個(gè)復(fù)孔，在每個(gè)復(fù)孔中加入20μl(1 IU/μl)重組IL-2。取四組處死BN大鼠的剩余血清及術(shù)前舌靜脈采血取得的血清，采用雙抗體夾心ABE-ELISA法來(lái)檢測(cè)IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量。余大鼠觀察生存期，并且分別于病毒給予當(dāng)天和第1、3、7、10、14、21和28天取大鼠尾靜脈血，收集血清。用ELISA法檢測(cè)血清中OX40Ig蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 (1)預(yù)試驗(yàn)組的手術(shù)成功率和7天生存率分

9、別為27.5％和0；實(shí)驗(yàn)熟練組分別為75.0％和40.0％；實(shí)驗(yàn)完善組分別為93.3％和86.7％。 (2)手術(shù)的成功率是93.7％(30/32)。實(shí)驗(yàn)組大鼠在術(shù)后7～10天表現(xiàn)出明顯的急性排斥癥狀。實(shí)驗(yàn)組的生存時(shí)間是9.17±1.17(天)，而對(duì)照組是50.17±8.50(天)。實(shí)驗(yàn)組的肝功能(AST、ALT、TB)明顯高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第7天的血清IFN-γ和IL-2濃度明顯高于術(shù)前，而IL-4和IL-10濃度則明顯低于

10、術(shù)前；對(duì)照組正好與此相反，術(shù)后第7天的血清IFN-γ和IL-2濃度明顯低于術(shù)前，而IL-4和IL-10濃度明顯高于術(shù)前。受體大鼠術(shù)后肝臟病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第7天出現(xiàn)中度細(xì)胞性排斥，10天出現(xiàn)重度細(xì)胞性排斥，而對(duì)照組術(shù)后第7和第10天呈輕微細(xì)胞性排斥。此外，實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞凋亡數(shù)較對(duì)照組顯著增多。 (3)經(jīng)酶切反應(yīng)及DNA測(cè)序鑒定，重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX40Ig序列正確。重組腺病毒質(zhì)粒pAdOX401g轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，

11、轉(zhuǎn)染第3天在熒光顯微鏡下能觀察到熒光。反復(fù)凍融的重組病毒子經(jīng)多輪感染后，檢測(cè)效價(jià)達(dá)到1010pfu/ml。重組腺病毒AdOX40Ig的Western印跡鑒定可以看到48.7kD的條帶。 (4)在普通光鏡視野下觀察1、10、25、50、100MOI不同劑量重組腺病毒感染組HL-7702細(xì)胞均形態(tài)正常，生長(zhǎng)良好；而200MOI劑量感染組細(xì)胞圓縮、脫落，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性；在熒光視野下，10、25、50、100、200MOI不同劑量重

12、組腺病毒感染組HL-7702細(xì)胞幾乎所有細(xì)胞均可觀察到綠色熒光。 AdvOX40Ig感染組HL-7702細(xì)胞能檢測(cè)到Cy3紅色熒光，而Ad空病毒感染組和未感染組HL-7702細(xì)胞則未出現(xiàn)紅色熒光。ELISA測(cè)定顯示，AdOX40Ig感染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中OX40Ig濃度明顯高于無(wú)病毒感染組和AdEGFP感染組。 (5)AdOX40Ig處理組和FK506處理組受體大鼠存活時(shí)間明顯超過(guò)對(duì)照組和空載病毒AdEGFP處理組，肝功

13、能(AST、ALT、TB)明顯低于對(duì)照組和空載病毒AdEGFP處理組，肝細(xì)胞性排斥明顯低于對(duì)照組和空載病毒AdEGFP處理組，肝細(xì)胞凋亡也明顯少于對(duì)照組和空載病毒AdEGFP處理組。術(shù)后AdOX40Ig處理組和FK506處理組受體大鼠血清中IFN-γ、IL-2的含量較術(shù)前明顯降低，而IL-4和IL-10的含量則較術(shù)前明顯升高；對(duì)照組和空載病毒AdEGFP處理組大鼠肝移植術(shù)后排斥組血清中IFN-γ、IL-2的含量較術(shù)前明顯升高，而IL-4

14、和IL-10的含量較術(shù)前明顯降低。AdOX40Ig處理組和FK506處理組的CPM值均明顯高于對(duì)照組和空載病毒AdEGFP處理組。在BN大鼠與Lewis大鼠的MLR反應(yīng)體系中，加入重組IL-2，Ad0X40Ig處理組和FK506處理組CPM值下降輕，與未加入重組IL-2的CPM值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在BN大鼠與F344大鼠的MLR反應(yīng)體系中，CPM值結(jié)果顯示對(duì)照組、空載病毒AdEGFP處理組和Ad0X40Ig處理組相互之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

15、義上的差異，但是這三組的CPM值均明顯高于FK506處理組。 結(jié)論: (1)熟練和完善的外科操作技術(shù)是手術(shù)成功的關(guān)鍵；縮短無(wú)肝期時(shí)間是術(shù)后長(zhǎng)期生存的有效保障。 (2)以近交系Lewis大鼠為供體、BN大鼠為受體的組合發(fā)生的急性排斥反應(yīng)強(qiáng)烈而且穩(wěn)定，是理想的大鼠肝臟移植急性排斥模型。 (3)重組腺病毒pAdOX40Ig構(gòu)建成功，檢測(cè)效價(jià)達(dá)到1010pfu/ml。 (4)結(jié)果表明10、25、50、10

16、0MOI不同劑量病毒感染HL-7702細(xì)胞對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，而且呈很高的感染效率，其可達(dá)90％以上，這提示10MOI為最佳感染劑量。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果和ELISA法測(cè)定結(jié)果均表明，腺病毒介導(dǎo)的外源性O(shè)X40基因能在HL-7702細(xì)胞中成功表達(dá)。 (5)用OX40Ig處理供肝具有FK506的抗急性排斥反應(yīng)的功能，具體表現(xiàn)在，用AdOX40Ig處理的大鼠存活時(shí)間長(zhǎng)，肝細(xì)胞性排斥輕，肝細(xì)胞凋亡少，肝功能損害輕，免疫反應(yīng)向Th2細(xì)胞偏