腺病毒介導的重組人HIF-1α基因誘導大鼠后肢缺血骨骼肌組織血管再生的作用.pdf

1、第一部分重組人HIF-1α的真核表達載體質粒的構建和鑒定 目的：構建重組人HIF-1α真核表達載體質粒，為進行治療性血管再生研究做準備。 方法：從HeLa細胞中提取總RNA，RT-PCR法反轉錄合成cDNA。設計兩對引物分別調取目的基因片段A和B，與T載體連接后轉化大腸桿菌JM109，LB平板培養(yǎng)基篩選菌落，抽提質粒。測序正確后雙酶切先后克隆進入pcDNA4/HisMaxA載體。 結果：獲得重組的人HIF-1α真

2、核表達載體質粒，經(jīng)PCR擴增獲得的目的基因分子量與預計的相同，插入pcDNA4/HisMaxA載體部位正確。 結論：重組的人HIF-1α，所選用的pcDNA4/HisMax可高表達目的基因，為利用其進行治療性血管再生研究奠定了基礎。 第二部分重組人HIF-1α的真核表達載體質粒的功能表達 目的：構建編碼重組人HIF-1α真核表達載體質粒，研究體外培養(yǎng)的哺乳細胞中靶基因表達的有效性。 方法：從HeLa細胞中

3、提取總RNA，RT-PCR法反轉錄合成cDNA。設計兩對引物分別調取目的基因片段A和B，與T載體連接后轉化大腸桿菌JM109，LB平板培養(yǎng)基篩選菌落，抽提質粒。測序正確后雙酶切先后克隆進入pcDNA4/HisMaxA載體。用構建完成的重組HIF-1α質粒和空白病毒轉染人胃癌SGC-7901細胞，并在不同時相收集轉染的細胞進行RT-PCR和Westernblot檢測。 結果：檢測靶基因VEGFmRNA表達及其蛋白翻譯的結果類似。轉

4、染細胞24-72小時之后，重組HIF-1α質粒各組VEGFmRNA的表達水平均明顯高于對照各組，差異顯著(P＜0.001)。與空白對照組相比，重組rHIF-1α質粒組VEGF蛋白的表達在24小時組即有明顯增加，但與48小時組相比差異無顯著性(P＞0.05)與72小時組相比差異顯著(P＜0.001)。72小時組的表達量最高，與其它各組比較差異均顯著(P＜0.001)。 結論：成功構建了重組的人HIF-1α質粒載體之后，在體外轉染哺

5、乳細胞中可有效地表達靶基因VEGFmRNA并翻譯成相應的蛋白，達到了實驗的目的。為利用其進行治療性血管再生研究奠定了基礎。 第三部分應用AdMax腺病毒載體系統(tǒng)構建人HIF-1α重組腺病毒 目的：利用AdMax腺病毒載體系統(tǒng)構建人重組HIF-1α基因腺病毒并在293細胞中擴增制備重組病毒。 方法：自先期構建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表達載體中用RT-PCR法擴增出rhHIF-1α基因片段，將其克隆入線性

6、化的pEGFP1-C1質粒中，用PCR法擴增EGFP-rhHIF-1α基因片段，將其克隆入PUC18質粒中。酶切構建好的pUC18-rhHIF-1α載體并克隆進入穿梭質粒PDC316中，將構建好的穿梭質粒PDC316-rhHIF-1α載體和骨架病毒pBHGlox△1，3Cre共轉染293細胞，包裝成重組的病毒顆粒，熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達。 結果：經(jīng)限制性內切酶檢測和GFP表達證實成功地構建了攜帶重組人HIF-α基因的重組腺病

7、毒載體并制備出高滴度重組病毒。 結論：成功地構建了攜帶rhHIF-1α基因片段的重組腺病毒載體，為進一步血管再生研究奠定了基礎。 第四部分 腺病毒介導的重組人HIF-1α誘導大鼠后肢缺血模型的血管再生作用 目的：觀察成年大鼠和老年大鼠體內注射先期構建的腺病毒介導的重組人HIF-1α表達載體在缺血的骨骼肌組織對血管的再生作用并進行比較。 方法：建立大鼠后肢缺血模型，成年(n=8)及老年(n=7)組均

8、隨機分成缺血對照組(A、C組)和缺血治療組(B、D組)。建模24小時后，B、D兩組右后肢缺血骨骼肌局部5處分別注射腺病毒rh-HIF-1α載體(每處1×108pfu/0.1m1)，A、C兩組在左后肢相應部位注入PBS液(每處0.1m1)。術后2周、4周麻醉大鼠后，切取四組大鼠后肢缺血骨骼肌組織進行HE染色和血管內皮細胞的免疫組化檢查。 結果：實驗動物大體觀察B、D組在同等干預下，術后四周后肢缺血狀況有明顯改善，與自身對照組及術后