減阻劑對大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注的影響.pdf

1、背景:周圍血管疾病(Pedpheral arterial disease,PAD)是一類臨床常見疾病,由于粥樣硬化斑塊、血栓、動脈炎癥等原因造成的動脈狹窄或閉塞,發(fā)病機理包括血液微循環(huán)、流變學、血小板功能、凝血機制、免疫、代謝等方面的異常。大血管狹窄或閉塞后,其供血區(qū)的骨骼肌發(fā)生缺血損傷,進而導致靜息痛、間歇性跛行、肢體壞疽等一系列臨床癥狀。目前治療方法包括溶栓、外科手術、介入取栓等,可以起到開通大血管的作用,而對于大血管閉塞后微循環(huán)的

2、損傷缺少良好的治療手段。治療性血管新生是通過人為的向局部缺血組織輸送血管生長因子、基因或重組蛋白的方式促進血管新生,從而改善缺血組織的缺血缺氧狀態(tài)[1-3]。近年來該研究取得了一定的成果,但是這類生長因子在誘導血管再生的過程中,其不可控的促血管再生效應可能出現(xiàn)許多并發(fā)癥[4,5],目前臨床應用仍很局限。那么,尋找其他的治療手段就顯得很有意義了。
　　 血管發(fā)生(neovascularization)包含血管新生(angiogen

3、esis)和小動脈形成(arteriogenesis)[2]。血管新生的驅動因素是缺氧,而動脈形成的始動因素是血流切應力(fluid shear stress,FSS)的增加[6]。豬急性股動脈閉塞的模型中,在閉塞遠端造成人工動-靜脈瘺,發(fā)現(xiàn)可促進更多側支循環(huán)的建立,局部血運狀態(tài)的改善情況明顯優(yōu)于促血管生長因子的作用[7]。表明持續(xù)增加缺血組織的血流切應力能明顯促進局部小動脈形成。那么,能否通過增加血流剪切力促進小動脈形成來治療缺血性疾

4、病呢?
　　 1948年英國科學家Toms報導了Toms現(xiàn)象(Toms phenomenon)[8],他發(fā)現(xiàn)一類特殊可溶性高分子聚合物,它可以在不影響流體粘滯度的同時明顯減少管道液體的流動阻力,這類高分子聚合物被稱為“減阻劑”(Drag-reducingpolymers,DRPs)。至今,減阻劑已經(jīng)廣泛應用于醫(yī)學研究、石油、消防、灌溉、航海等領域。
　　 近年來減阻劑在醫(yī)學領域倍受關注,已先后證明減阻劑具有改善急性心肌缺

5、血動物預后、改善失血性休克微循環(huán)灌注、改善糖尿病動物微循環(huán)障礙等方面的作用,并能通過增加血流剪切力的作用減少動脈粥樣硬化斑塊的形成。表明減阻劑在缺血性心血管疾病、失血性休克、動脈粥樣硬化等循環(huán)系統(tǒng)疾病的治療方面有很大的發(fā)展前景。我課題組證實PEO能促進大鼠急性后肢缺血骨骼肌血流灌注的恢復[11],并直接觀察到PEO可提高微動脈血管壁的切應力30％[12],表明DRPs可以提高缺血組織的血供狀況,為急性缺血疾病治療提供新的思路,并為進一探

6、討DRPs恢復慢性缺血組織血供提供了基礎,但是目前除了減阻劑干預動脈粥樣硬化斑塊形成的研究外,減阻劑的研究都局限于急性血管閉塞、狹窄或失血性休克等狀態(tài)血流動力學的改變,而慢性缺血性疾病的研究尚未見報道,能否利用PEO增加血流剪切力的作用來治療缺血性疾病呢?
　　 本實驗擬通過超聲造影方法測定微循環(huán)血流量,觀察PEO對外周動脈完全閉塞情況下慢性缺血骨骼肌微循環(huán)灌注的影響,并探討減阻劑通過提高血流剪切力促進缺血組織動脈生長(arte

7、riogenesis)的可能性。
　　 第一部分:對比超聲定量大鼠后肢骨骼肌絕對血流量的研究
　　 [目的]建立“應用對比超聲技術定量大鼠骨骼肌絕對血流量”的方法學,并評價該方法的穩(wěn)定性及可重復性。
　　 [方法]
　　 1.動物準備:SPF級Wistar雄性大鼠12只,3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,大鼠心前區(qū)及左側后肢備皮,仰臥固定于鼠板上。
　　 2,超聲造影劑全氟丙烷人血白蛋白微泡注射劑(“

8、全氟顯”),濃度約為(1.0～2.0)×109/ml,微泡大小2.0～4.0μm,實驗時以0.9％氯化鈉注射液3ml稀釋并搖勻待用。
　　 3.造影方法:使用Sequoia512超聲診斷儀(17L5探頭),將探頭定位在左室短軸切面,通過輸液泵持續(xù)滴注造影劑“全氟顯”(20μl/min)達穩(wěn)態(tài)濃度后,以對比脈沖序列模式(Coherent Pulse Sequence,CPS),R波觸發(fā)間歇成像取圖；再將超聲探頭定位在大鼠后肢中部(

9、髕骨和踝關節(jié)連線中點),參數(shù)保持不變,以時間觸發(fā)(間隔500ms)成像,當靜注造影劑(200μl/min)至充盈達穩(wěn)態(tài)穩(wěn)定后,以高機械指數(shù)破壞造影劑微泡后開始存取骨骼肌組織內造影劑再充填過程的全部圖像。
　　 7天后按照上述的實驗步驟再重復一次造影。
　　 4.骨骼肌血流量的計算方法造影圖像脫機使用MCE分析軟件(OHSU,USA)分析,測定左室心腔造影穩(wěn)態(tài)時的平均聲學強度ALV,骨骼肌造影的聲學平臺強度Am及造影劑再填

10、充速率βm。大鼠骨骼肌肌肉密度ρm=1.05g/ml,本實驗中骨骼肌造影所用造影劑濃度為心腔造影所用濃度的10倍,故大鼠骨骼肌的絕對血流量為60×βm×Am/(ALV×10)/1.05(單位:ml·g-1·min-1)。
　　 [結果]經(jīng)靜脈注射“全氟顯”后,大鼠心腔和后肢骨骼肌均獲得滿意的顯像效果。同一只大鼠先后兩次造影得出的骨骼肌毛細血管容積,血流速度及標化計算后的骨骼肌的血流量統(tǒng)計學上未見顯著性差異(P>0.05)。超聲造

11、影定量血流參數(shù)曲線的擬合優(yōu)度良好,決定系數(shù)為0.944±0.046(0.789～0.985),P<0.01。
　　 [結論]以左室腔聲學造影強度為參照行聲學造影檢查能準確定量大鼠后肢骨骼肌的絕對血流量,該方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性,可視為一種在活體定量肌肉組織絕對血流量的新方法。
　　 第二部分:減阻劑對大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注的影響
　　 [目的]建立大鼠慢性后肢骨骼肌缺血模型,通過靜脈給予藥物治療,應

12、用超聲造影方法測量大鼠后肢骨骼肌的血流量變化及應用免疫組化方法研究血管的變化,評價減阻劑對大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注的影響,并初步探索減阻劑增加血流灌注的機理,為構建缺血性疾病新的治療手段奠定基礎。
　　 [方法]
　　 1.減阻劑的配制方法:PEO溶解于生理鹽水中成0.1％的濃度,放置于分子截留量為50KDa的透析袋中透析24小時,使用小過濾器(孔徑0.21am)將溶液中的細菌濾除后,用凝膠滲透色譜法測定溶液中PE

13、O的分子量為4.99×106Da,,生理鹽水稀釋成50ppm的濃度待用。
　　 2.大鼠輸液通道的建立:麻醉狀態(tài)下分離頸靜脈,插入靜脈留置導管,將導管用縫線在皮下多處固定后,經(jīng)皮下隧道引導至背部切口并固定。大鼠分籠飼養(yǎng),每日予0.1ml肝素生理鹽水(10 iu/ml)沖管。
　　 3.大鼠單側后肢慢性缺血模型的建立:輸液通道建立后3天,3％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。沿大鼠右側后肢腹股溝韌帶下緣做一1cm長切口,分離右股動脈

14、及其分支剝離并以5—0細絲線結扎后切斷,避免傷及靜脈及神經(jīng),左側后肢不做處理。
　　 4.給藥方法:將大鼠隨機分成兩組,于缺血后第1、3、5、7、9、11、13天清醒自由活動狀態(tài)下通過輸液通道給藥,治療組予減阻劑(30min,給藥速度以體重計算血容量,使血中PEO濃度達到2μg/ml),對照組予以相同的速度相同時間給予生理鹽水,治療結束后予0.1ml肝素鹽水(10iu/ml)沖管,小鋼絲封閉輸液導管。
　　 5.聲學造影

15、評價大鼠后肢骨骼肌血流:于術前及術后第1、3、7、14、21、28天行聲學造影檢查,方法同第一部分。
　　 6.血流儲備檢測:于第28天行平靜狀態(tài)下聲學造影檢測后,持續(xù)滴注“全氟顯”(200μl/min),造影模式和參數(shù)不變,使用臨時起搏器刺激大鼠后肢骨骼肌(頻率為120次/分)2分鐘后,開始取圖。脫機使用MCE軟件分析圖像,記錄A、β及A×β值。血流儲備即為起搏后的A×β值與起搏前的A×β值的比值。
　　 7.病理學檢

16、測:第28天行超聲造影后予較大量的麻藥處死動物,行HE染色及α-actin抗體免疫組化染色。
　　 [結果]
　　 4周后,減阻劑治療組大鼠缺血后肢的血流量顯著高于鹽水對照組(0.319±0.044 vs0.211±0.040 ml/g/min,P=0.001):減阻劑治療組慢性缺血后肢的血流儲備亦高于鹽水對照組(3.227±0.941 vs1.867±0.551,P=0.012);減阻劑組大鼠后肢缺血的骨骼肌血管容積較

17、生理鹽水組比較有顯著增加(0.446±0.111 vs0.310±0.059,P=0.024)；HE染色提示:大鼠非缺血后肢骨骼肌細胞形態(tài)正常,無充血、水腫,鹽水組及減阻劑組的缺血骨骼肌中均有炎癥細胞浸潤,鹽水組骨骼肌細胞可見水腫,而減阻劑組的細胞未見明顯水腫；免疫組化提示減阻劑組的每高倍鏡下小動脈個數(shù)較鹽水組的多(9.25±1.72 vs6.23±0.86,P=0.026)。
　　 [結論]
　　 減阻劑能增加大鼠慢性