腺病毒介導(dǎo)CTLA4Ig和CD40Ig基因轉(zhuǎn)染對人皮膚成纖維細(xì)胞免疫性能影響的體外研究.pdf

1、異基因(異體、異種)皮膚移植后的排斥反應(yīng)主要是由活化T細(xì)胞主導(dǎo)的急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)，此過程中T細(xì)胞共刺激信號的參與對于T細(xì)胞活化和免疫排斥的發(fā)生是必需的，阻斷共刺激信號，可導(dǎo)致T細(xì)胞無反應(yīng)、細(xì)胞凋亡或克隆丟失，從而誘導(dǎo)免疫耐受。在已發(fā)現(xiàn)的多種T細(xì)胞共刺激信號中，公認(rèn)最為重要的是B7-CD28信號和CD40-CD40L信號。利用蛋白或抗體可有效對其阻斷，誘導(dǎo)免疫耐受，但存在制備復(fù)雜、成本較高、半衰期短和需要長期施用等弊端。腺病毒載體安全性

2、高、制備容易以其介導(dǎo)基因治療的方式將共刺激分子基因?qū)氚屑?xì)胞中，使治療性蛋白在特定區(qū)域表達(dá)，阻斷共刺激信號，有望降低成本、延長效應(yīng)時間。皮膚成纖維細(xì)胞易獲取、培養(yǎng)及大量擴增，也是常用的組織工程皮膚種子細(xì)胞和皮膚基因治療理想的靶細(xì)胞。因此本研究以體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞為靶細(xì)胞，用腺病毒介導(dǎo)CTLA4Ig和CD40Ig基因轉(zhuǎn)染阻斷公認(rèn)最為重要的B7/CD28和CD40/CD40L信號，通過對Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig感

3、染人皮膚成纖維細(xì)胞的效率檢測、感染后細(xì)胞形態(tài)和增殖能力檢測、目的蛋白表達(dá)檢測及對其免疫性能影響檢測，研究、評價腺病毒基因治療方式介導(dǎo)CTLA4Ig和CD40Ig阻斷雙共刺激信號應(yīng)用于人皮膚成纖維細(xì)胞修飾和治療的效果和可行性，為其應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。其主要內(nèi)容如下： 1.采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測腺病毒對體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明：Adv-EGFP在感染復(fù)數(shù)(MOI)為50，100時對人皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約為51

4、.7+7.24％、69.99±3.26％，同時對細(xì)胞形態(tài)和增殖能力無明顯影響。因此本研究選用100為腺病毒感染人皮膚成纖維細(xì)胞的MOI。 2.采用形態(tài)學(xué)觀察和MTT法細(xì)胞活力檢測重組腺病毒轉(zhuǎn)染對體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞生長形態(tài)和增殖能力的影響。結(jié)果表明：重組病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig在MOI為100時單獨和混合轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞后，實驗組與對照組細(xì)胞形態(tài)均呈長梭形、不規(guī)則三角形，平行、放射狀或漩渦狀分布，

5、有較長胞質(zhì)突起，輪廓清晰，并且各組細(xì)胞增殖能力無顯著差異(P>0.05)。 3.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測重組腺病毒介導(dǎo)CTLA4Ig和CD40Ig在體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：重組病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig在MOI為100單獨和混合轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞后，在培養(yǎng)上清中均檢測到相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)，其表達(dá)量分別是：Adv-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染組：CTLA4Ig 2.79

6、±0.08ug/ml：Adv-CD40Ig轉(zhuǎn)染組;CD40Ig 1.25±0.11ug/ml：Adv-CTLA4Ig+Adv-CD40Ig轉(zhuǎn)染組：CTLA4Ig2.14±0.21ug/ml，CD40Ig 1.00±0.04ug/ml。 4.采用重組腺病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig轉(zhuǎn)染后的體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞與人外周血單個核細(xì)胞混合培養(yǎng)檢測對人皮膚成纖維細(xì)胞免疫性能的影響。結(jié)果顯示：重組病毒Adv-CTLA4

7、Ig、Adv-CD40Ig以MOI為100單獨和混合轉(zhuǎn)染的體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞對人外周血單個核細(xì)胞增殖抑制均優(yōu)于對照組，有顯著性差異(單處理組P<0.05，混合組P<0.01)，Adv-CTLA4Ig和Adv-CD40Ig混合處理組抑制效果優(yōu)于各單處理組(P<0.05)達(dá)到31.67±2.25％，Adv-CTLA4Ig處理組(23.41±1.23％)優(yōu)于Adv-CD40Ig(19.83±4.71％)(P<0.05)。 綜上所

8、述，重組腺病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig可以有效轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞；介導(dǎo)CTLA4Ig和CD40Ig表達(dá)；對細(xì)胞生長形態(tài)和增殖能力無明顯影響；通過腺病毒介導(dǎo)方式能有效阻斷B7/CD28、CD40/CD40L共刺激信號，抑制體外培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞增殖，阻斷B7/CD28信號誘導(dǎo)抑制效果優(yōu)于CD40/CD40L信號，阻斷雙信號可更大程度誘導(dǎo)免疫抑制，因共刺激信號多樣、免疫反應(yīng)復(fù)雜性及施用量、處理時間的原因，并