腺病毒介導(dǎo)的CTLA4Ig基因?qū)餐瑢?dǎo)入的LacZ基因在致敏大鼠脊髓表達的影響.pdf

1、目的：周圍神經(jīng)損傷是臨床上常見疾病，周圍神經(jīng)損傷的顯微外科修復(fù)技術(shù)已經(jīng)十分精湛，卻長期以來難以獲得滿意結(jié)果。隨著分子生物學(xué)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)不斷進步，神經(jīng)損傷的基因治療研究正在興起。應(yīng)用復(fù)制缺陷型重組腺病毒(Adenovirus,AdV)為載體將各種神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)入脊髓以保護受損的神經(jīng)元和促進周圍神經(jīng)再生的研究，已成為神經(jīng)修復(fù)研究領(lǐng)域的前沿課題?；蛑委煹男Ч蕾囉趯⒛康幕蛱禺?、高效和安全的轉(zhuǎn)染受損神經(jīng)元及神經(jīng)并高效表達，但由于宿主對

2、病毒載體的免疫反應(yīng)，使導(dǎo)入的基因不能在體內(nèi)長時間高水平表達，從而限制了導(dǎo)入基因的治療作用的發(fā)揮。此技術(shù)最終應(yīng)用于人類，而人類大部分在一生開始的幾年中被野生型的腺病毒感染。因此，在相當多的應(yīng)用腺病毒載體的基因治療的臨床應(yīng)用中，為了分析和控制對載體得免疫反應(yīng)用病毒預(yù)先致敏動物是非常重要的。本實驗為了提高腺病毒介導(dǎo)的基因表達，將攜帶LacZ基因的AdV(AdLacZ)與不帶外源基因的AdO或與攜帶有細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(Cyt

3、otoxic T lymphocyte-associatedantigen 4immunoglobulin，CTLA4Ig)基因的 AdV(AdCTLA4Ig)兩種腺病毒混懸液通過微量注射導(dǎo)入已被腺病毒致敏的大鼠腰膨大脊髓實質(zhì)內(nèi)，比較共同轉(zhuǎn)染AdCTLA4Ig后β-gal在脊髓表達水平變化；并通過對大鼠血清抗病毒抗體和中和抗體滴度檢測，以探討CTLA4Ig誘導(dǎo)機體對AdLacZ的免疫耐受的作用及其機理。方法：選用7周齡健康雌性Wiste

4、r大鼠120只，體重200～250g。將大鼠隨機分成兩組，每組60只。在往大鼠脊髓注射病毒之前7天，在胸背側(cè)皮下注射AdLacZ進行預(yù)處理。對照組(A組)導(dǎo)入AdlacZ+AdO，實驗組(B組)導(dǎo)入AdlacZ+AdCTLA4Ig。將大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg)，麻醉成功后固定于腦立體定位儀上。取長約3cm后正中切口，去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-III型手動推進器，

5、于脊髓后正中動脈右側(cè)1mm處注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和AdO(5×109pfu/ml)各1μl(A組)或AdLacZ(1×109pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109 pfu/ml)各1μl(B組)。針尖向頭側(cè)呈45度斜行進針，斜行刺入深度為2.5mm。注射速度為1μl/min，注射完畢后滯針5min，緩慢拔針。充分止血、沖洗傷口，局部噴灑抗生素預(yù)防感染，關(guān)閉傷口。兩組在轉(zhuǎn)染病毒后5個不同的時間點大鼠心臟取血3

6、.5ml；在轉(zhuǎn)染后5個不同時間點，對兩組動物脊髓進行厚50μm的連續(xù)冰凍橫切片，計數(shù)A組與B組中X-gal染色陽性的切片數(shù)，分析比較兩組LacZ基因在脊髓表達的高峰期和持續(xù)時間；并檢測血清抗病毒中和抗體滴度；用多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測腺病毒注入后在血中消失時間。 結(jié)果： 1X-gal，CTLA4Ig轉(zhuǎn)基因表達：LacZ基因和CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染脊髓雙側(cè)的前角運動細胞和周圍的膠質(zhì)細胞。轉(zhuǎn)基因表達范圍局限于注射點上下各

7、0.5cm區(qū)段，表達高峰時有轉(zhuǎn)基因表達的陽性冰凍橫切片數(shù)≤120片。切片觀察可見A組的X-gal染色陽性表達時間約為30天；而B組的X-gal染色陽性表達時間約為60天。脊髓陽性切片計數(shù)顯示兩組β-gal在脊髓表達的高峰期均在9～15天，統(tǒng)計學(xué)分析表明兩組之間在高峰期間陽性切片數(shù)有顯著差異(P<0.05)。并且AdLacZ基因在脊髓表達的時間明顯延長。 2抗病毒中和抗體滴度測定：從用AdLacZ預(yù)先皮下致敏的大鼠收集的陽性對照血清證實中

8、和抗體的效價≥1：128，A組轉(zhuǎn)染病毒后第15天血清中可檢測到低效價抗病毒中和抗體(1:4)，并一直持續(xù)至30天。B組在轉(zhuǎn)染后第30天，血清中可檢測到低效價抗病毒中和抗體(1:4)，并一直持續(xù)至60天。與A組相比B組抗體滴度水平低，并且血中產(chǎn)生中和抗體持續(xù)在一個很低水平。在統(tǒng)計學(xué)上兩組有顯著差異(P<0.05). 3血標本腺病毒PCR檢測：用PCR法從DNA水平分別檢測腺病毒在A組、B組的表達情況，腺病毒的DNA量是隨時間延長逐

9、漸下降的，A組至30天檢測不到腺病毒的表達，B組60天時仍能檢測到腺病毒的表達(見附圖16，17)結(jié)論：在預(yù)先致敏的大鼠體內(nèi)，將AdV介導(dǎo)的CTLA4Ig基因注射入脊髓能有效地抑制局部T淋巴細胞的浸潤，從而減輕由AdV介導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)，抑制機體對病毒載體的排斥反應(yīng)，顯著延長LacZ基因在脊髓的表達時間，并且能明顯增強與其共同導(dǎo)入的LacZ基因表達強度。而且AdCTLA4Ig對體液免疫應(yīng)答有明顯的抑制作用，能明顯延長腺病毒在體內(nèi)的存留時