腺病毒介導CTLA4Ig治療小鼠舍格倫綜合征的實驗研究.pdf

1、目的：舍格倫綜合征(Sj(o)gren'ssyndrome，SS)是一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，主要特征為累及唾液腺、淚腺等外分泌腺，引起腺體分泌功能障礙，出現(xiàn)眼干、口干等癥狀。主要發(fā)病機制為T細胞介導的自身免疫反應，其病理特征為外分泌腺淋巴細胞浸潤，腺管擴張，腺泡破壞。由于確切的發(fā)病機理還不清楚，目前沒有有效的治療措施。本實驗用BALB/c小鼠創(chuàng)建SS的動物模型，構建CTLA4Ig(細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4融合蛋白；cytotox

2、icTlymphocyticassociatedantigen4immunoglobulin)重組腺病毒載體(Ad-CTLA4Ig)并將其注入動物體內，觀察CTLA4Ig的基因轉染治療對SS免疫反應的阻斷作用。從而為Ad-CTLA4Ig治療SS的臨床應用奠定實驗基礎。方法：構建CTLA4Ig基因重組腺病毒，制作舍格倫綜合征小鼠的動物模型，將腺病毒載體介導CTLA4Ig通過腹腔給藥途徑注入小鼠體內，與胸腺肽治療進行對比，觀察Ad-CTLA

3、4Ig對SS的治療效果。 方法： 本實驗分三個步驟：1、CTLA4Ig基因重組腺病毒的構建及擴增：首先，應用高效細菌內同源重組系統(tǒng)，構建了攜帶CTLA4Ig基因的重組腺病毒載體。酶切pCTLA4Ig基因和穿梭質粒pAdTrack-cmv，構建重組穿梭質粒，與腺病毒骨架質粒pAdeasy-1在BJ5183感受態(tài)大腸桿菌進行同源重組，脂質體介導共轉染293細胞，重組腺病毒在其中復制、擴增。利用報告基因綠色熒光蛋白(GFP)可

4、以在熒光顯微鏡下直接觀察病毒的轉染和感染效率。經反復感染-收集-凍融后，將感染后的293細胞裂解上清CsCl梯度離心純化，測定重組腺病毒pAdEasy-1/CTLA4Ig的病毒滴度；2、BALB/c小鼠SS動物模型的建立：運用BALB/c小鼠頜下腺組織勻漿與弗氏完全佐劑(CFA)混勻多點注射小鼠足墊，再注射百日咳疫苗加強免疫，誘導SS動物模型；3、Ad-CTLA4Ig對SS的治療觀察：Ad-CTLA4Ig通過腹腔給藥阻止SS的病理過程，

5、與胸腺肽治療進行對比，觀察頜下腺病理改變，周飲水量、靜態(tài)唾液總流率、外周血CD4+T細胞含量以及頜下腺AQP5表達量的變化，以此判定治療效果。 結果： 1.成功構建CTLA4Ig基因重組腺病毒，測定重組腺病毒pAdEasy-1/CTLA4Ig滴度為5X1010pfu/ml。本實驗所用的重組腺病毒在感染范圍內，不會引起毒性反應。 2.SS動物模型制備結果：根據(jù)Chrisholm提出的SS病人唇腺活檢分級標準進行判定

6、，模型組BALB/c小鼠全部發(fā)病，發(fā)病率為100％；臨床表現(xiàn)為唾液流率下降，周飲水量增加，出現(xiàn)口渴癥狀；病理表現(xiàn)為頜下腺組織中出現(xiàn)淋巴細胞浸潤灶，頜下腺導管擴張，腺泡破壞，上皮島形成。 3.對比不同治療方法的治療效果： 3.1飲水量：測定每組最后1周的飲水量，與胸腺肽組及SS組比較，Ad-CTLA4Ig組小鼠周飲水量明顯減少，說明有效的改善了小鼠的口渴癥狀。 3.2靜態(tài)唾液總流率：靜態(tài)唾液總流率可通過10min的

7、唾液總量來表示，Ad-CTLA4Ig組小鼠靜態(tài)唾液總流率明顯大于胸腺肽組及SS組，說明小鼠唾液腺分泌功能得到明顯改善。 3.3病理檢查：切片顯示胸腺肽組與SS組小鼠在出現(xiàn)程度不一的淋巴細胞浸潤，頜下腺導管擴張，腺泡破壞，上皮島形成。而Ad-CTLA4Ig組小鼠頜下腺病理改變明顯減輕。 3.4CD4+T細胞流式分析Ad-CTLA4Ig組小鼠的外周血CD4+T細胞含量接近正常，而與胸腺肽組及SS組外周血CD4+T細胞含量明顯

8、增高。 3.5APQ5蛋白印跡結果各組樣本中均檢測到AQP5的表達：出現(xiàn)分子量為27KD的條帶。小鼠頜下腺組織總蛋白Westernblot分析結果顯示，Ad-CTLA4Ig組AQP5的表達量與胸腺肽組及SS組比較顯著升高。 結論： 1.Ad-CTLA4Ig通過對T淋巴細胞的有效抑制，從而正向調節(jié)小鼠頜下腺AQP5的表達。 2.Ad-CTLA4Ig對SS治療效果明顯優(yōu)于胸腺肽，提示通過CTLA4抑制免疫反應