CTLA4Ig修飾的樹突狀細(xì)胞對哮喘小鼠氣道炎癥及Th失衡的干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的改良培養(yǎng)
　　 目的：運(yùn)用改良方法，簡單、經(jīng)濟(jì)地從小鼠骨髓誘導(dǎo)和擴(kuò)增得到大量高純度樹突狀細(xì)胞(DCs)。
　　 方法：梯度密度離心法從小鼠骨髓分離得到單個(gè)核細(xì)胞，低密度接種骨髓單個(gè)核細(xì)胞于24孔板，加入含rmGM-CSF10 ng/ml和rmIL-45 ng/ml的RPMI1640全培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 d，LPS刺激成熟。光鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞特異性表面標(biāo)

2、志、單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)鑒定細(xì)胞刺激同種異體淋巴細(xì)胞的能力、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12釋放水平。
　　 結(jié)果：每只小鼠骨髓約可得到2×107個(gè)DCs，細(xì)胞呈典型的樹突狀突起，高表達(dá)特異性表面標(biāo)志物CD11c(90.01％)，高表達(dá)MHCⅡ類分子、CD86、CD80、CD40及CCR7，具有較強(qiáng)的促進(jìn)T細(xì)胞增殖功能與釋放IL-12能力。
　　 結(jié)論：方法改良后可簡單從小鼠骨髓獲得高

3、純度、具有功能的樹突狀細(xì)胞。
　　 第二部分、CTLA4Ig修飾的樹突狀細(xì)胞體外對Th亞群分化的影響
　　 目的：探討細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)修飾的樹突狀細(xì)胞(DC-CTLA4Ig)體外對Th亞群分化的影響。
　　 方法：通過重組腺病毒載體將目的基因(CTLA4Ig)轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓來源的DCs。采用FCM檢測細(xì)胞表面分子和胞內(nèi)CTLA4Ig的表達(dá)；MLR檢測DCs刺激同種異體T細(xì)胞

4、的能力，ELISA法檢測抗原提呈反應(yīng)共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10的分泌水平，F(xiàn)CM檢測該共培養(yǎng)體系中Th1，Th2及Treg水平。
　　 結(jié)果：CTLA4 Ig基因成功轉(zhuǎn)染至DCs，轉(zhuǎn)染率約為80％，制備的DC-CTLA4Ig穩(wěn)定表達(dá)CTLA4Ig，表面分子CD86呈現(xiàn)低表達(dá)；與對照組相比，DC-CTLA4Ig有效抑制T細(xì)胞增殖，降低共培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平，增加IL-10分泌，使IFN

5、-γ/IL-4比值亦有所上升；DC-CTLA4Ig雖使共培養(yǎng)體系中Th1及Th2水平同時(shí)降低，但Th1/Th2比值增加；DC-CTLA4Ig可上調(diào)Treg水平，并降低Th2/Treg比值。
　　 結(jié)論：通過腺病毒將CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染DCs并且高效表達(dá)，可有效降低DCs表面CD86分子，抑制同種異體T細(xì)胞反應(yīng)，并能影響體外Th1/Th2和Th2/Treg水平。
　　 第三部分、激發(fā)階段回輸DC-CTAL4Ig對哮喘小鼠

6、氣道炎癥及Th失衡的干預(yù)作用
　　 目的：研究建模激發(fā)階段回輸DC-CTLA4Ig對哮喘小鼠氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的治療作用并觀察其可能機(jī)制。
　　 方法：SPF級BALB/c小鼠90只，隨機(jī)分為正常對照組、哮喘模型組、DC-GFP對照組和DCs對照組和DC-CTLA4Ig干預(yù)組。哮喘模型組用OVA致敏和激發(fā)；正常對照組用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替；DC-GFP對照組、DCs對照組和DC-CTLA4Ig干預(yù)組于首次激發(fā)前

7、30min分別回輸DC-GFP、DCs和DC-CTLA4Ig，余處理同模型組。觀察小鼠哮喘發(fā)作情況，肺組織病理切片檢測氣道炎癥，體描法檢測小鼠氣道高反應(yīng)性，檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)及分類，ELISA法檢測BALF和血清中細(xì)胞因子IFN-γ，IL-4和IL-10的水平，F(xiàn)CM檢測肺和脾臟Th1，Th2和Treg水平。
　　 結(jié)果：與哮喘模型組、DC-GFP對照組和DCs對照組小鼠比較，DC-CTLA4Ig激發(fā)期

8、尾靜脈回輸可明顯減輕小鼠的急性哮喘發(fā)作癥狀；減輕氣道炎癥和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；降低小鼠氣道高反應(yīng)性；降低氣道局部IL-4水平，增加IFN-γ和IL-10水平；降低肺部Th2比例，增加肺部Th1和Treg比例；但對血清中細(xì)胞因子水平和脾臟Th亞群無明顯調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)論：激發(fā)期尾靜脈回輸DC-CTLA4Ig可明顯減輕小鼠急性哮喘發(fā)作癥狀，減輕氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)性，而其可能機(jī)制與降低氣道局部Th2細(xì)胞因子分泌，增加氣道局部T

9、h1細(xì)胞因子分泌，糾正氣道局部Th1/Th2和Th2/Treg失衡有關(guān)。
　　 第四部分、致敏階段回輸DC-CTAL4Ig對哮喘小鼠氣道炎癥及Th失衡的干預(yù)作用
　　 目的：研究致敏階段回輸DC-CTLA4Ig對哮喘小鼠氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的防治作用及其可能機(jī)制。
　　 方法：SPF級BALB/c小鼠90只，隨機(jī)分為正常對照組、哮喘模型組、DC-GFP對照組和DCs對照組和DC-CTLA4Ig干預(yù)組。哮喘模型組

10、用OVA致敏和激發(fā)；正常對照組用生理鹽水代替；DC-GFP對照組、DCs對照組和DC-CTLA4Ig干預(yù)組于0、14d致敏前30 min分別回輸DC-GFP、DCs和DC-CTLA4Ig，余處理同模型組。觀察小鼠哮喘發(fā)作情況，肺組織病理切片檢測氣道炎癥，體描法檢測小鼠氣道高反應(yīng)性，檢測BALF中白細(xì)胞總數(shù)及分類，ELISA法檢測BALF和血清中細(xì)胞因子IFN-γ，IL-4和IL-10的水平，F(xiàn)ACS檢測肺和脾臟Th1，Th2和Treg水

11、平。
　　 結(jié)果：與哮喘模型組、DC-GFP對照組和DCs對照組小鼠比較，致敏期尾靜脈回輸DC-CTLA4Ig可明顯減輕小鼠的急性哮喘發(fā)作癥狀；減輕氣道炎癥和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；降低小鼠氣道高反應(yīng)性；降低氣道局部IL-4水平，增加IFN-γ和IL-10水平；降低肺部Th2比例，增加肺部Th1和Treg比例；但對血清中細(xì)胞因子水平和脾臟Th亞群無明顯調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)論：致敏期尾靜脈回輸DC-CTLA4Ig可明顯減輕小鼠急