Cd3001f基因修飾樹突狀細胞對過敏性哮喘小鼠氣道炎癥的作用研究.pdf

1、過敏性哮喘是以氣道高反應性(airwayhypersensitivity，AHR)、嗜酸性粒細胞和Th2細胞過度浸潤以及血清高水平IgE為特征的慢性氣道變應性炎癥性疾病。目前研究認為，T淋巴細胞優(yōu)勢性分泌IL-4、IL-5、IL-13等Th2類細胞因子在過敏性哮喘的引發(fā)中扮演著重要角色。
　　 Cd3001f(CD300antigenlikefamilymemberF)分子是一個氨基端帶有信號肽、胞外段帶有IgV樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)

2、、胞內(nèi)段帶有免疫受體酪氨酸抑制基序(immune-receptortyrosine-basedinhibitorymotifs，ITIM)和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)化基序(immune-receptortyrosine-basedswitchingmotif，ITSM)的I型糖蛋白，有研究顯示，阻斷或沉默樹突狀細胞表面Cd3001f分子的表達能夠促進樹突狀細胞啟動的T細胞增殖以及抗原特異性T細胞應答，表明Cd3001f分子具有負向調(diào)控樹突狀細胞

3、啟動T細胞應答的功能。
　　 在本研究中，我們根據(jù)GenBank提供的小鼠Cd3001f基因核酸序列(NM145634.3)，設計含完整開放閱讀框(openreadingframe，ORF)的Cd3001f基因特異性引物，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)從小鼠骨髓來源樹突狀細胞(bonemarrow-deriveddendritic

4、cells，BMDCs)中擴增得到Cd3001f基因，將其與pMD-18T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-Cd3001f。經(jīng)生物信息學分后，設計特異性引物以重組質(zhì)粒pMD-Cd3001f為模板聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，PCR)擴增Cd3001f基因編碼區(qū)不合信號肽的胞外段，將其與pGEX-4T-3載體連接構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pGEX-Cd3001f(22aa-185aa)。原核表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ros

5、etta(E3)后，經(jīng)IPTG誘導表達了約45.5kD的GST-Cd3001f(22aa-185aa)融合蛋白。表達產(chǎn)物經(jīng)GSTrapFF親和層析柱純化后皮下免疫接種新西蘭大白兔，制備了抗GST-Cd3001f(22aa-185aa)融合蛋白多克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)結(jié)果顯示，其抗體效價高達1:16384。將Cd3001f基因真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞(h

6、umanembryonickidney293cells，HEK293)，間接免疫熒光實驗(indirectimmunofluorescenceassays，IIFA)和免疫印跡實驗(Westernblot)檢測兔抗GST-Cd3001f(22-185aa)融合蛋白多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示，該多克隆抗體能夠特異性的識別Cd3001f真核表達蛋白。
　　 根據(jù)siRNA設計原則，設計5對小鼠Cd3001f基因保守序列編碼短發(fā)卡R

7、NA(shorthairpinRNA，shRNA)的正義、反義寡核苷酸鏈，將其退火后分別克隆至pLL3.7質(zhì)粒載體中獲得Cd3001f基因shRNA表達質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體法，分別將Cd3001f基因shRNA表達質(zhì)粒與Cd3001f基因真核表達質(zhì)粒pCDNA-Cd3001f共轉(zhuǎn)染HEK293細胞48小時。Real-timePCR分析顯示，重組質(zhì)粒pLL-Cd3001f-shRNAe對Cd3001f基因mRNA抑制率為75.6％。以重組質(zhì)粒

8、pMD18-Cd3001f為模板PCR擴增Cd3001f基因，將其插入穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中。以重組質(zhì)粒pLL-Cd3001f-shRNAe為模板PCR擴增含U6啟動子的Cd3001f基因shRNA，將其插入穿梭質(zhì)粒pAdTrack中。PmeⅠ酶切陽性重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化含重組腺病毒骨架質(zhì)粒Adeasy-1的感受態(tài)菌BJ5183，進行同源重組。PacⅠ酶切重組腺病毒載體后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細胞。轉(zhuǎn)染后12-18天，獲得重組

9、腺病毒Ad-Cd3001f、Ad-Cd3001f-shRNA。大量擴增重組腺病毒，并采用CsCl密度梯度離心法進行純化。重組腺病毒Ad-Cd3001f滴度為1.4×109PFU/ml，Ad-Cd3001f-shRNA滴度為2.6×109PFU/ml。以感染復數(shù)(amultiplicityofinfection，MOI)為75的重組腺病毒感染BMDCs48小時。Real-timePCR分析顯示，Ad-Cd3001f感染細胞中Cd3001f

10、基因mRNA的表達水平顯著升高，而Ad-Cd3001f-shRNA感染細胞中Cd3001f基因mRNA表達水平下降達51.7%。Westernblot分析顯示，Ad-Cd3001f感染細胞特異性地表達了Cd3001f蛋白。
　　 分別于第0天、第14天給C57BL/6小鼠腹腔注射經(jīng)凝膠佐劑乳化的卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)，第二次致敏后10天OVA溶液連續(xù)激發(fā)3天。以MOI為75的重組腺病毒Ad-Cd3001f(DC

11、-Cd3001f)和Ad-Cd3001f-shRNA(DC-siCd3001f)分別感染培養(yǎng)5天的BMDCs24小時，再用OVA激發(fā)24小時。分別于OVA首次致敏前7天和致敏后3天小鼠腹腔注射DC-Cd3001f或DC-siCd3001f。最后一次激發(fā)后24小時，檢測氣道高反應性。吉姆薩瑞氏染色行肺泡灌洗液炎性細胞分類計數(shù)。H&E和PAS染色觀察肺組織病理學變化。ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage

12、fluid，BALF)、脾細胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的含量。流式細胞術(shù)檢測脾細胞中CD4+Foxp3+Tregs和CD4+IL-17A+Th17的百分比。研究結(jié)果顯示，DC-siCd3001f免疫哮喘小鼠后能夠減輕氣道高反應性和肺組織炎癥，降低肺泡灌洗液和脾細胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5和IL-13的分泌，提高脾細胞中CD4+Foxp3+Tregs的百分比，降低脾細胞中CD4+IL-17A+Th17的百分