從DC-Th軸探討CD86-siRNA基因修飾樹突狀細胞在變應性鼻炎中的作用研究.pdf

1、目的:
　　變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是發(fā)生在鼻粘膜的變態(tài)反應性疾病，其發(fā)病以兒童和青壯年居多。據(jù) WHO近年公布的數(shù)據(jù)表明全世界目前超過5億人罹患此病。流行病學資料也顯示，在2008年美國變應性鼻炎的發(fā)病率高達16.7％，在慢性病中居第5位，而AR也是兒童最常見的慢性疾病，每年用于診治變應性鼻炎的費用高達數(shù)十億美元。而在我國，2007年公布的國內(nèi)11個中心城市的流行病學資料，成人自報患病率介于9-24

2、.6%，兒童則介于1.8-13.67%。變應性鼻炎雖不會引起嚴重后果，但能很大程度影響患者日常生活質(zhì)量。目前，對變應性鼻炎最常用的治療方案是鼻噴糖皮質(zhì)激素和口服抗組胺藥，該方法雖然能快速控制鼻過敏性炎癥，有效緩解臨床癥狀，卻不能阻止變應性鼻炎反復發(fā)作，距治愈的目標尚遠。研究表明，僅有約60%的患者對變應性鼻炎的治療總體上感到非常滿意，且隨著時間的推移，藥物治療的療效會逐漸減弱，這些治療上的困難究其原因在于變應性鼻炎的發(fā)病機制尚未完全明了

3、，難以探索出更為有效的治療手段。因此，加大對變應性鼻炎發(fā)病機制的研究和防治措施的探討是目前耳鼻咽喉科學領域高度重視和急待解決的重點之一。
　　變應性鼻炎的病因尚不明確，一般認為與特應性個體、遺傳學背景及環(huán)境因素有關。大量的實驗研究證實，鼻變態(tài)反應的發(fā)病機制是以Th2反應為主的變態(tài)反應性疾病，即Th1/Th2失衡引發(fā)的下游生物效應導致變應性鼻炎的發(fā)生，但最近隨著研究的進一步深入，有些學者提出新識別的T細胞亞群可能對Th2細胞的分化有

4、調(diào)節(jié)作用，如CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對Th2細胞所介導的呼吸道變應性炎癥發(fā)揮強大的抑制作用。變應性個體可能存在Treg/Th2失衡，但其復雜的信號傳導途徑和機制仍在研究和探索中，這必將為變應性鼻炎提供新的治療靶點。
　　DC是體內(nèi)功能最強大的專職抗原提呈細胞，也是唯一能使初始T淋巴細胞活化的APC，在免疫系統(tǒng)中處于啟動、調(diào)控并維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)。有研究證實變應性鼻炎體內(nèi)Th2的極化狀態(tài)與DC細胞的功能異常有關， DC成為

5、研究影響T細胞活化與增殖的重要靶細胞。未成熟DC由于其表面缺乏共刺激因子，在體內(nèi)或體外均顯示出誘導Treg細胞的特性,因此采用基因修飾的方法對DC加以修飾，使其保持穩(wěn)定的未成熟DC的特性，從而達到抑制效應T細胞的活化而增強Treg細胞活化的目的。
　　本課題擬以AR為研究對象，闡明AR中是否存在Treg/Th2失衡并以DC-Th細胞間相互作用為主線，以慢病毒載體CD86-siRNA對DC的調(diào)控為切入點，闡述AR中基因修飾DC對Tr

6、eg/Th2失衡的調(diào)控，說明Th失衡的上游事件及其免疫調(diào)控因素，為AR發(fā)病機制的研究提供新的思路。
　　方法:
　　1、納入排除標準：本研究嚴格按照中華醫(yī)學會變應性鼻炎診斷和治療指南（2009，武夷山），所有入組患者均來自重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科門診，均為首次診斷，未接受變應性鼻炎相關治療，對照組排除有感染性的、占位性的、藥物誘導性鼻炎和有任何并發(fā)癥的患者，在獲得其家長知情同意后，將其納入研究對象。
　　2、

7、探討AR患者與正常對照外周血中Treg/Th2細胞亞群分布及與臨床癥狀的關系、Treg/Th2相關細胞因子及轉錄因子的表達差異。
　?。?）按照ELISA試劑盒操作步驟檢測AR患者與正常對照外周血中總IgE、IL-4、IL-5、TGF-β1的含量。
　　（2）RT-PCR擴增檢測外周血轉錄因子FOXP3、GATA-3mRNA表達情況。
　　（3）采用Western Blot方法檢測AR患者及正常對照組外周血PBMC中F

8、OXP3、GATA-3蛋白水平。
　　3、慢病毒載體 siRNA序列轉染人樹突狀細胞沉默 CD86基因對Treg/Th2細胞分化的影響
　?。?）慢病毒載體siRNA的構建
　?。?）MACS分選人外周血CD14＋單核細胞并誘導成熟DC
　　（3）MACS分選人外周血CD4＋T細胞
　?。?）攜帶特異性siRNA的慢病毒轉染DC
　?。?） AR組未轉染DC、轉染后DC、正常對照組DC與外周血CD4＋

9、T細胞共培養(yǎng)
　　將未轉染DC、轉染后DC與外周血CD4＋T細胞共培養(yǎng)，按照ELISA試劑盒操作步驟檢測共培養(yǎng)上清液中 IL-4、IL-5、TGF-β1的含量，RT-PCR法檢測FOXP3、GATA-3mRNA水平，Western Blotting方法檢測FOXP3、GATA-3蛋白水平，以評價CD86基因修飾后DC對Th細胞分化的影響。
　　結果:
　?。?）AR組與對照組相比，血清總IgE水平、嗜酸性粒細胞比例、T

10、5SS均明顯升高，且血清總IgE水平、嗜酸性粒細胞比例與T5SS呈正相關，而TGF-β1/IL-4、TGF-β1/IL-5、FOXP3 mRNA/GATA3 mRNA、FOXP3 protein/GATA3 protein比值與T5SS呈負相關。
　?。?）ELISA檢測AR血清中IL-4, IL-5，TGF–β1的表達，AR組與對照組相比，IL-4, IL-5明顯增高，而TGF-β1的水平AR組明顯低于對照組。
　　RT-

11、PCR檢測Treg轉錄因子FOXP3 mRNA的表達，AR組明顯低于對照組，而AR組Th2轉錄因子GATA3 mRNA的表達明顯高于對照組。
　　Western blotting檢測 FOXP3與 GATA3蛋白表達水平，結果GATA3, FOXP3蛋白表達趨勢與二者mRNA的表達趨勢一致。
　?。?）應用MACS法從血液中成功提取CD14+單核細胞并刺激轉化成熟DC，成功提取CD4+T淋巴細胞，建立共培養(yǎng)體系（DC/CD4

12、+T1:4）；應用CD86-siRNA慢病毒成功轉染DC，MOI值20，轉染率約為60.2%；轉染后DC表面分子標志CD86的表達明顯下降；AR組未轉染，轉染后DC及正常對照組DC分別與CD4+T共培養(yǎng)，上清液中Th2型細胞因子IL-4、IL-5在siRNA轉染后其表達水平明顯低于未轉染組，但仍明顯高于正常對照組，而Treg型細胞因子TGF-β1在AR未轉染組的表達低于正常對照，siRNA轉染后其表達明顯高于未轉染組，但仍低于正常對照組

13、; Th2型轉錄因子 GATA3 mRNA水平及蛋白表達水平siRNA轉染后明顯低于未轉染組，但高于正常對照組，而Treg型轉錄因子FOXP3 mRNA水平及蛋白表達水平，AR組轉染后表達高于未轉染組，二組均低于正常對照組。
　　結論:
　　AR患者體內(nèi)FOXP3 mRNA和蛋白表達降低，而GATA3 mRNA和蛋白表達升高，F(xiàn)OXP3 mRNA/GATA3 mRNA、FOXP3蛋白/GATA3蛋白與AR的疾病嚴重程度（T5

14、SS）呈負相關,提示AR患者體內(nèi)可能存在另外一種免疫失衡即Treg/Th2失衡。
　　通過體外細胞共培養(yǎng)實驗，應用攜帶特異性CD86-siRNA序列慢病毒載體轉染人樹突狀細胞沉默CD86基因，結果顯示樹突狀細胞表面分子CD86的表達明顯減少，這種穩(wěn)定的、未成熟DC影響了T細胞的分化，表現(xiàn)為Treg表達升高而Th2細胞表達降低，提示AR患者可以通過基因修飾DC來調(diào)節(jié)T細胞的活化，即改變Treg/Th2平衡，從而說明DC-Th軸在AR