攜帶CTLA4Ig基因腺病毒載體對共同導入致敏大鼠脊髓的LacZ基因表達的影響.pdf

1、目的:隨著社會的發(fā)展,各種創(chuàng)傷發(fā)生越來越多,伴隨的神經系統(tǒng)損傷的數(shù)量也迅速的增加。但由于神經系統(tǒng)修復的復雜性和特殊,神經系統(tǒng)損傷的修復至今仍是一個非常棘手的難題。隨著分子生物學的發(fā)展,對于神經系統(tǒng)損傷的修復采用基因治療的方法,將外源性的神經營養(yǎng)因子的基因通過載體定向的導入神經斷端,利用受體細胞長期的高效的分泌神經營養(yǎng)因子,促進神經再生軸突的生長,從而促進神經損傷的修復,以期獲得良好的效果。雖然利用轉基因技術為神經的損傷修復提供了一個非常

2、好的方向,但由于受體對外源性基因及載體的免疫排斥作用,使得外源性基因的長期高效的表達不能實現(xiàn),這也就限制了神經修復的效果。針對這一瓶頸,本實驗采用導入帶有細胞毒T淋巴細胞相關抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4 immunoglobulin,CTLA4Ig)基因腺病毒AdV(Ad CTL A4Ig)和攜帶LacZ基因的AdV(AdL acZ)微量注射器共同導入大鼠脊髓腰膨

3、大處作為實驗組,將未攜帶外源性基因的AdO和攜帶LacZ基因的AdV(AdLacZ)通過微量注射器共同導入大鼠脊髓腰膨大處作為對照組,兩組通過比較β-gal在脊髓表達的變化,并通過多聚酶鏈反應(PCR)監(jiān)測腺病毒注入后在脊髓量的變化及消失時間和用逆轉錄多聚酶鏈反應(PT-PCR)法檢測CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表達,以探討CTLA4Ig誘導機體對AdLacZ的局部免疫耐受的作用及其機理。
　　 方法:選用7周齡

4、健康雌性Wister大鼠54只,體重200～250g。將大鼠隨機分成四組,A,B每組21只,C,D組每組6只。在往大鼠脊髓注射病毒之前7天,在胸背側皮下注射AdLacZ1μl進行預處理。對照組(A組、C組)導入AdlacZ+AdO,實驗組(B組、D組)導入AdlacZ+AdCTLA4Ig。將大鼠經腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于腦立體定位儀上。取長約3cm后正中切口,去除T13椎板暴露

5、脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-Ⅲ型手動推進器,于脊髓后正中動脈右側1mm處注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和AdO(5×109pfu/ml)各1μl(A組、C組)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109 pfu/ml)各1μl(B組、D組)。針尖向頭側呈45度斜行進針,斜行刺入深度為2.5mm。注射速度為1μl/min,注射完畢后滯針5min,緩慢拔針。充分止血、沖洗切口,局部噴灑抗生

6、素預防感染,關閉切口。逐層關閉切口,結束手術。自然條件下恢復清醒,相同條件下喂養(yǎng)進行觀察。C組和D組于距第一次手術30天后于脊髓后正中動脈左側1mm處注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和AdO(5×109pfu/ml)各1μl(C組)或AdLacz(1×109 pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109 pfu/ml)各1μl(D組)。其余手術方法相同。實驗組和對照組在轉染腺病毒后的9時間點取大鼠脊髓注射點遠近端5mm的腰膨

7、大節(jié)段,注射點頭側5mm的脊髓節(jié)段進行厚50μm的連續(xù)冰凍橫切片,對實驗組和對照組中X-gal染色陽性的切片進行計數(shù),并通過多聚酶鏈反應(PCR)監(jiān)測腺病毒注入后在脊髓量的變化及消失時間,用逆轉錄多聚酶鏈反應(PT-PCR)法檢測CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表達情況。
　　 結果:
　　 1 X-gal,CTLA4Ig轉基因表達:LacZ基因和CTLA4Ig基因轉染脊髓雙側的前角運動細胞和周圍的膠質細胞。

8、轉基因表達范圍局限于注射點上下各0.5cm區(qū)段,表達高峰時有轉基因表達的陽性冰凍橫切片數(shù)≤120片。切片觀察可見實驗對照組的X-gal染色陽性表達時間約為15天;而實驗組的X-gal染色陽性表達時間約為60天。實驗組脊髓陽性切片計數(shù)顯示β-gal在脊髓腰膨大表達的高峰期均在4天和9天,15天后β-gal在脊髓腰膨大X-gal染色陽性表達量逐步減少,在60天仍能見到低表達量。統(tǒng)計學分析表明兩組之間在高峰期間陽性切片數(shù)有顯著差異(P＜0.0

9、5)。并且AdLacZ基因在脊髓表達的時間明顯延長。
　　 2腺病毒液PCR檢測:腺病毒的表達量隨著濃度的降低而逐漸減小。采用病毒液10倍系列稀釋提取后DNA經PCR反應可檢測出腺病毒的特異性條帶的最低稀釋度為104。AdlacZ(1×109pfu/ml)與AdO(5×109 pfu/ml)特異性條帶的最低稀釋度一致。
　　 3脊髓標本腺病毒PCR檢測:用PCR法從DNA水平分別檢測腺病毒在實驗對照組、實驗組的表達情況,

10、腺病毒的DNA量是隨時間延長逐漸下降的,實驗對照組至39天檢測不到腺病毒的表達,實驗組60天時仍能檢測到腺病毒的表達。
　　 4 RT-PCR實驗的結果
　　 4.1β-gal RNA在大鼠脊髓腰膨大處局部表達
　　 用RT-PCR法從mRNA水平分別檢測β-gal在實驗對照組、實驗組的表達情況:轉染2天后兩組均可檢測出β-gal mRNA在大鼠脊髓腰膨大組織的表達,對照組在30天處未檢測β-gal的目標條帶,實

11、驗組在60天處仍可見到β-gal表達的目標條帶,但亮度以明顯變暗,可見在初次導入腺病毒及第二次導入腺病毒30天β-gal mRNA仍有低量的表達。
　　 4.2 CTLA4Ig mRNA在大鼠脊髓腰膨大組織局部的表達,用RT-PCR法從mRNA水平分別檢測CTLA4Ig mRNA在實驗組的表達情況。轉染2天后實驗組可檢測出CTLA4Ig mRNA在大鼠脊髓腰膨大組織的表達,在初次導入腺病毒的60天和第二次導入腺病毒的30天處可見

12、到CTLA4Ig mRNA的目標條帶,可見最亮處為初次導入的4天和9天處,第二次導入腺病毒的第9天和初次導入腺病毒的第9天出相比較暗。
　　 結論:在預先致敏的大鼠體內,將AdV介導的CTLA4Ig基因注射入脊髓腰膨大處能有效地抑制局部T淋巴細胞的浸潤,從而減輕由AdV介導的局部炎癥反應,抑制機體對病毒載體的排斥反應,顯著延長LacZ基因在脊髓的表達時間,并且能明顯增強與其共同導入的LacZ基因表達強度。而且AdCTLA4Ig對