攜帶CTLA4Ig基因腺病毒載體對(duì)共同導(dǎo)入致敏大鼠脊髓的LacZ基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的:隨著社會(huì)的發(fā)展,各種創(chuàng)傷發(fā)生越來越多,伴隨的神經(jīng)系統(tǒng)損傷的數(shù)量也迅速的增加。但由于神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的復(fù)雜性和特殊,神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)至今仍是一個(gè)非常棘手的難題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)采用基因治療的方法,將外源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因通過載體定向的導(dǎo)入神經(jīng)斷端,利用受體細(xì)胞長(zhǎng)期的高效的分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,促進(jìn)神經(jīng)再生軸突的生長(zhǎng),從而促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù),以期獲得良好的效果。雖然利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)為神經(jīng)的損傷修復(fù)提供了一個(gè)非常

2、好的方向,但由于受體對(duì)外源性基因及載體的免疫排斥作用,使得外源性基因的長(zhǎng)期高效的表達(dá)不能實(shí)現(xiàn),這也就限制了神經(jīng)修復(fù)的效果。針對(duì)這一瓶頸,本實(shí)驗(yàn)采用導(dǎo)入帶有細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4 immunoglobulin,CTLA4Ig)基因腺病毒AdV(Ad CTL A4Ig)和攜帶LacZ基因的AdV(AdL acZ)微量注射器共同導(dǎo)入大鼠脊髓腰膨

3、大處作為實(shí)驗(yàn)組,將未攜帶外源性基因的AdO和攜帶LacZ基因的AdV(AdLacZ)通過微量注射器共同導(dǎo)入大鼠脊髓腰膨大處作為對(duì)照組,兩組通過比較β-gal在脊髓表達(dá)的變化,并通過多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)監(jiān)測(cè)腺病毒注入后在脊髓量的變化及消失時(shí)間和用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(PT-PCR)法檢測(cè)CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表達(dá),以探討CTLA4Ig誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)AdLacZ的局部免疫耐受的作用及其機(jī)理。
　　 方法:選用7周齡

4、健康雌性Wister大鼠54只,體重200～250g。將大鼠隨機(jī)分成四組,A,B每組21只,C,D組每組6只。在往大鼠脊髓注射病毒之前7天,在胸背側(cè)皮下注射AdLacZ1μl進(jìn)行預(yù)處理。對(duì)照組(A組、C組)導(dǎo)入AdlacZ+AdO,實(shí)驗(yàn)組(B組、D組)導(dǎo)入AdlacZ+AdCTLA4Ig。將大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于腦立體定位儀上。取長(zhǎng)約3cm后正中切口,去除T13椎板暴露

5、脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-Ⅲ型手動(dòng)推進(jìn)器,于脊髓后正中動(dòng)脈右側(cè)1mm處注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和AdO(5×109pfu/ml)各1μl(A組、C組)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109 pfu/ml)各1μl(B組、D組)。針尖向頭側(cè)呈45度斜行進(jìn)針,斜行刺入深度為2.5mm。注射速度為1μl/min,注射完畢后滯針5min,緩慢拔針。充分止血、沖洗切口,局部噴灑抗生

6、素預(yù)防感染,關(guān)閉切口。逐層關(guān)閉切口,結(jié)束手術(shù)。自然條件下恢復(fù)清醒,相同條件下喂養(yǎng)進(jìn)行觀察。C組和D組于距第一次手術(shù)30天后于脊髓后正中動(dòng)脈左側(cè)1mm處注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和AdO(5×109pfu/ml)各1μl(C組)或AdLacz(1×109 pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109 pfu/ml)各1μl(D組)。其余手術(shù)方法相同。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在轉(zhuǎn)染腺病毒后的9時(shí)間點(diǎn)取大鼠脊髓注射點(diǎn)遠(yuǎn)近端5mm的腰膨

7、大節(jié)段,注射點(diǎn)頭側(cè)5mm的脊髓節(jié)段進(jìn)行厚50μm的連續(xù)冰凍橫切片,對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中X-gal染色陽性的切片進(jìn)行計(jì)數(shù),并通過多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)監(jiān)測(cè)腺病毒注入后在脊髓量的變化及消失時(shí)間,用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(PT-PCR)法檢測(cè)CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1 X-gal,CTLA4Ig轉(zhuǎn)基因表達(dá):LacZ基因和CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染脊髓雙側(cè)的前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞和周圍的膠質(zhì)細(xì)胞。

8、轉(zhuǎn)基因表達(dá)范圍局限于注射點(diǎn)上下各0.5cm區(qū)段,表達(dá)高峰時(shí)有轉(zhuǎn)基因表達(dá)的陽性冰凍橫切片數(shù)≤120片。切片觀察可見實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的X-gal染色陽性表達(dá)時(shí)間約為15天;而實(shí)驗(yàn)組的X-gal染色陽性表達(dá)時(shí)間約為60天。實(shí)驗(yàn)組脊髓陽性切片計(jì)數(shù)顯示β-gal在脊髓腰膨大表達(dá)的高峰期均在4天和9天,15天后β-gal在脊髓腰膨大X-gal染色陽性表達(dá)量逐步減少,在60天仍能見到低表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩組之間在高峰期間陽性切片數(shù)有顯著差異(P＜0.0

9、5)。并且AdLacZ基因在脊髓表達(dá)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)。
　　 2腺病毒液PCR檢測(cè):腺病毒的表達(dá)量隨著濃度的降低而逐漸減小。采用病毒液10倍系列稀釋提取后DNA經(jīng)PCR反應(yīng)可檢測(cè)出腺病毒的特異性條帶的最低稀釋度為104。AdlacZ(1×109pfu/ml)與AdO(5×109 pfu/ml)特異性條帶的最低稀釋度一致。
　　 3脊髓標(biāo)本腺病毒PCR檢測(cè):用PCR法從DNA水平分別檢測(cè)腺病毒在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)情況,

10、腺病毒的DNA量是隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降的,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組至39天檢測(cè)不到腺病毒的表達(dá),實(shí)驗(yàn)組60天時(shí)仍能檢測(cè)到腺病毒的表達(dá)。
　　 4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
　　 4.1β-gal RNA在大鼠脊髓腰膨大處局部表達(dá)
　　 用RT-PCR法從mRNA水平分別檢測(cè)β-gal在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)情況:轉(zhuǎn)染2天后兩組均可檢測(cè)出β-gal mRNA在大鼠脊髓腰膨大組織的表達(dá),對(duì)照組在30天處未檢測(cè)β-gal的目標(biāo)條帶,實(shí)

11、驗(yàn)組在60天處仍可見到β-gal表達(dá)的目標(biāo)條帶,但亮度以明顯變暗,可見在初次導(dǎo)入腺病毒及第二次導(dǎo)入腺病毒30天β-gal mRNA仍有低量的表達(dá)。
　　 4.2 CTLA4Ig mRNA在大鼠脊髓腰膨大組織局部的表達(dá),用RT-PCR法從mRNA水平分別檢測(cè)CTLA4Ig mRNA在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染2天后實(shí)驗(yàn)組可檢測(cè)出CTLA4Ig mRNA在大鼠脊髓腰膨大組織的表達(dá),在初次導(dǎo)入腺病毒的60天和第二次導(dǎo)入腺病毒的30天處可見

12、到CTLA4Ig mRNA的目標(biāo)條帶,可見最亮處為初次導(dǎo)入的4天和9天處,第二次導(dǎo)入腺病毒的第9天和初次導(dǎo)入腺病毒的第9天出相比較暗。
　　 結(jié)論:在預(yù)先致敏的大鼠體內(nèi),將AdV介導(dǎo)的CTLA4Ig基因注射入脊髓腰膨大處能有效地抑制局部T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn),從而減輕由AdV介導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng),抑制機(jī)體對(duì)病毒載體的排斥反應(yīng),顯著延長(zhǎng)LacZ基因在脊髓的表達(dá)時(shí)間,并且能明顯增強(qiáng)與其共同導(dǎo)入的LacZ基因表達(dá)強(qiáng)度。而且AdCTLA4Ig對(duì)