MicroRNA-491靶向作用EGFR通過STAT3信號通路在肝細胞癌腫瘤干細胞特性中作用的機制研究.pdf

1、目的:
　　闡述miR-491對肝癌腫瘤干細胞特性獲得的分子調(diào)控機制及其對肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的影響，為今后肝癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后復(fù)發(fā)的診斷、靶向治療以及患者預(yù)后預(yù)測提供新的途徑和研究思路。
　　方法:
　　一、miR-491在腫瘤組織、正常組織的表達與肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的相關(guān)關(guān)系
　　1.肝癌組織與正常組織miRNA-491表達差異檢測:實時定量轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法檢測miRNA-491在腫瘤組織

2、和正常組織中的表達;
　　2.肝癌細胞miR-491和檢測:實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法檢測miR-491在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞系中表達水平;
　　二、miR-491影響肝癌細胞腫瘤干細胞特性獲得
　　miR-491表達水平變化對肝癌細胞集落形成能力及腫瘤干細胞成球能力影響檢測:肝癌細胞MHCC97H和HepG2內(nèi)分別轉(zhuǎn)染miR-491-mimic/inhibitor，腫瘤細胞集落形成實驗及懸浮克隆細胞球

3、形成實驗檢測腫瘤干細胞性的變化。
　　三、miR-491在肝癌細胞系中通過EGFR調(diào)控STAT3
　　1.miR-491表達水平變化對肝癌細胞EGFR和STAT3表達影響檢測:肝癌細胞MHCC97H和HepG2內(nèi)分別轉(zhuǎn)染miR-491-mimic/inhibitor，Western blot檢測EGFR和STAT3蛋白及磷酸化水平變化;
　　2.miR-491表達水平變化對肝癌細胞EGFR的影響檢測:肝癌細胞MHCC9

4、7H細胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染pEGFP-EGFR3'UTR-Luc和miR-491-mimic，肝癌細胞HepG2內(nèi)共轉(zhuǎn)染pEGFP-EGFR3'UTR-Luc和miR-491-inhibitor,熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測EGFR熒光素酶活性變化;
　　3.EGFR表達水平變化對肝癌細胞STAT3的影響檢測:肝癌細胞HepG2內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor24 h后，繼續(xù)用EGFR siRNA處理細胞12h，Western blot

5、檢測EGFR和STAT3蛋白水平變化，肝癌細胞MHCC97H內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-mimic24 h后，繼續(xù)用EGFR高表達質(zhì)粒處理細胞12h，Westem blot檢測EGFR和STAT3蛋白水平變化。
　　四、EGFR/STAT3對肝癌細胞腫瘤干細胞特性獲得及侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　1.EGFR/STAT3表達水平變化對肝癌細胞腫瘤干細胞成球能力影響及腫瘤細胞集落形成能力檢測:肝癌細胞MHCC97H內(nèi)共轉(zhuǎn)染miR-491-m

6、imic及STAT3高表達質(zhì)粒和肝癌細胞HepG2細胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor及STAT3 siRNA，懸浮克隆細胞球形成實驗及集落形成實驗檢測腫瘤干細胞成球能力變化。
　　2.EGFR/STAT3表達水平變化對肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測:肝癌細胞MHCC97H內(nèi)共轉(zhuǎn)染miR-491-mimic及STAT3高表達質(zhì)粒和肝癌細胞HepG2細胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor及STAT3siRNA，trans

7、well實驗檢測腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力變化。
　　結(jié)果:
　　一、miR-491和肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能和腫瘤組織相關(guān)
　　qRT-PCR方法分別檢測肝癌細胞系和肝癌組織、正常組織miR-491表達水平結(jié)果發(fā)現(xiàn):miR-491表達與細胞轉(zhuǎn)移潛能呈負相關(guān)，在肝癌組織中表達遠低于正常組織。
　　二、miR-491影響肝癌細胞腫瘤干細胞特性獲得結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-491-mimic的MHCC97H細胞腫瘤干細胞成球能力較對照組

8、顯著降低;而轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor的HepG2細胞腫瘤干細胞成球能力較對照組明顯升高。
　　三、miR-491在肝癌細胞系中通過EGFR調(diào)控STAT3
　　1.在肝癌細胞MHCC97H中上調(diào)miR-491后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR蛋白水平明顯降低，STAT3蛋白磷酸化水平均明顯降低;而肝癌細胞HepG2下調(diào)miR-491后，EGFR蛋白水平明顯升高，STAT3蛋白磷酸化水平明顯升高;
　　2.肝癌細胞MHCC

9、97H內(nèi)共轉(zhuǎn)染pEGFP-EGFR3'UTR-Luc和miR-491-mimic，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR與miR-491啟動子區(qū)能夠結(jié)合，上調(diào)miR-491水平， EGFR熒光素酶活性下降，肝癌細胞HepG2內(nèi)共轉(zhuǎn)染pEGFP-EGFR-3'UTR-Luc和miR-491-inhibitor，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR與miR-491啟動子區(qū)能夠結(jié)合，下調(diào)miR-491水平，EGFR熒光素酶活性上升。說明在肝癌細胞中，miR-491可以直接靶向調(diào)控EG

10、FR;
　　3.使用miR-491-inhibitor處理HepG2細胞后，再用EGFR siRNA處理HepG2細胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制EGFR可使miR-491所致HepG2細胞STAT3的蛋白磷酸化水平升高回降;使用miR-491-mimic處理MHCC97H細胞后，再用EGFR高表達質(zhì)粒處理細胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達EGFR可使miR-491所致MHCC97H細胞STAT3蛋白磷酸化水平降低回升。說明miR-491所致肝癌細胞ST

11、AT3表達水平變化是通過EGFR來完成的。
　　四、miR-491/STAT3對肝癌細胞干細胞特性和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　1.肝癌細胞MHCC97H內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-mimic后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞成球及集落形成能力亦明顯減弱，共轉(zhuǎn)染miR-491-mimic及STAT3高表達質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達STAT3可使miR-491-mimic所致腫瘤于細胞成球能力及集落形成減弱回高;肝癌細胞HepG2內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-i

12、nhibitor后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞成球及集落形成能力明顯升高，共轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor及STAT3 siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達STAT3可使miR-491-inhibitor所致腫瘤干細胞成球及集落形成能力能力升高回降。
　　2.肝癌細胞MHCC97H內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-mimic后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱，共轉(zhuǎn)染miR-491-mimic及STAT3高表達質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達STAT3可使mi

13、R-491-mimic所致腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱回高;肝癌細胞HepG2內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯升高，共轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor及STAT3 siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達STAT3可使miR-491-inhibitor所致腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力升高回低。
　　結(jié)論:
　　1.miR-491和腫瘤細胞惡性程度及肝癌分期相關(guān);
　　2.miR-491在肝癌細胞