MicroRNA-630在肝細(xì)胞癌中通過(guò)TGF-β-miR-630-Slug信號(hào)通路調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分：MiR-630在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與肝癌病人預(yù)后的關(guān)系
　　目的：以97例肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本為基礎(chǔ)，結(jié)合病人的臨床資料和預(yù)后隨訪資料，研究miR-630在肝癌組織中的表達(dá)情況，探討miR-630的表達(dá)與肝癌病人臨床病理參數(shù)及手術(shù)預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：連續(xù)選取2010年1月至2012年12月間在華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院肝臟外科中心手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌組織97例，全部標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理科組織學(xué)確診，結(jié)合肝癌病人臨床病理參數(shù)

2、及預(yù)后隨訪進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：結(jié)合臨床資料顯示：miR-630的表達(dá)與肝癌轉(zhuǎn)移，包膜完整性，腫瘤的分化程度（Edmonson分級(jí)），腫瘤的TNM分期，腫瘤的BCLC分期分級(jí)相關(guān)。將97例肝癌組織表達(dá)miR-630從高到低排序，以中位數(shù)為界，高于中位數(shù)的歸為高表達(dá)組，反之歸為低表達(dá)組。結(jié)合隨訪資料分析顯示，miR-630表達(dá)水平相對(duì)高的病人較之表達(dá)水平相對(duì)低的病人具有更低的復(fù)發(fā)率和更長(zhǎng)的總體生存時(shí)間。四個(gè)表卡方檢驗(yàn)顯示：miR-6

3、30的表達(dá)與AFP水平，腫瘤數(shù)目，血管侵襲，Edmonson分級(jí)，BCLC分期呈負(fù)相關(guān)。單因素分析顯示：miR-630的表達(dá)水平的降低是一個(gè)評(píng)估肝癌病人手術(shù)切除治療后復(fù)發(fā)和生存時(shí)間的一個(gè)顯著而獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)論： miR-630相對(duì)高表達(dá)的肝癌病人提示可能具有較低的轉(zhuǎn)移概率和較好的預(yù)后。
　　第二部分：MiR-630在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抑制侵襲，轉(zhuǎn)移的作用
　　目的：這部分以中等轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系為研究工具，通過(guò)

4、轉(zhuǎn)染miR-630的模擬物mimics或者miR-630的抑制物來(lái)研究miR-630對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響。
　　方法：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mimics或inhibitors，在轉(zhuǎn)染后的5天內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。如：用CCK-8實(shí)驗(yàn)，探討miR-630對(duì)細(xì)胞增值能力的影響；用Transwell實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，探討miR-630對(duì)細(xì)胞遷移或者侵襲能力的影響；用免疫熒光實(shí)驗(yàn)，探討miR-630對(duì)細(xì)胞形態(tài)及上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化的影響。以慢病毒為工

5、具構(gòu)建穩(wěn)定的miR-630敲減的細(xì)胞系，用裸鼠皮下成瘤模型，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中探討miR-630對(duì)肝癌致瘤性的影響；用裸鼠肝臟原位種植模型，探討miR-630對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果：在中等轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞中，無(wú)論是轉(zhuǎn)染miR-630 mimics還是inhibitors細(xì)胞的增值能力都沒(méi)有發(fā)生改變。轉(zhuǎn)染miR-630 mimics的細(xì)胞，遷移，侵襲能力都減弱，細(xì)胞形態(tài)更上皮化；而轉(zhuǎn)染了 inhibitors的細(xì)胞遷移，侵襲能力都增強(qiáng)

6、，細(xì)胞發(fā)生了間質(zhì)樣的改變。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞穩(wěn)定敲減miR-630并沒(méi)有改變肝癌細(xì)胞系的致瘤能力；然而卻增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞系肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移的能力。
　　結(jié)論：miR-630能抑制肝癌細(xì)胞的遷移，侵襲，上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)移，而對(duì)增值能力沒(méi)有影響。
　　第三部分：miR-630在肝癌中通過(guò)抑制Slug調(diào)控肝癌生物學(xué)行為
　　目的：探討 miR-630在肝癌中通過(guò)抑制何種可能的癌基因調(diào)控肝癌惡性生物學(xué)行為的。
　　方法

7、：用生物信息庫(kù)預(yù)測(cè)miR-630的靶基因；熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄分析，免疫組化，Western blotting，RT-PCR檢測(cè)Slug是否為miR-630的靶基因。用Transwell,劃痕，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，Western blotting，RT-PCR在功能學(xué)角度驗(yàn)證miR-630通過(guò)靶向抑制Slug從而抑制肝細(xì)胞癌的遷移，侵襲，上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)果：熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄分析顯示miR-630能結(jié)合Slug mRNA3

8、’ UTR端；免疫組化相關(guān)性分析顯示肝癌組織中miR-630的表達(dá)與Slug呈負(fù)相關(guān)；Western blotting，RT-PCR檢測(cè)顯示miR-630能抑制Slug的表達(dá)，以及抑制上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化相關(guān)的間質(zhì)樣標(biāo)記物；Transwell，劃痕實(shí)驗(yàn)顯示抑制Slug能逆轉(zhuǎn)miR-630 inhibitors導(dǎo)致的遷移，侵襲能力增強(qiáng)；細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，Western blotting，RT-PCR檢測(cè)顯示抑制Slug能逆轉(zhuǎn)miR-630 in

9、hibitors導(dǎo)致的上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化相關(guān)的標(biāo)記物表達(dá)改變。
　　結(jié)論：miR-630在肝細(xì)胞癌中通過(guò)靶向抑制Slug調(diào)控其遷移，侵襲，上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化。
　　第四部分：在肝癌細(xì)胞中TGF-β通過(guò)Erk/SP1，JNK/c-jun信號(hào)通路抑制miR-630表達(dá)
　　目的：研究調(diào)控miR-630的上游信號(hào)通路
　　方法：利用 RT-PCR檢測(cè) TGF-β對(duì) miR-630表達(dá)的影響；用 NCBI(http://www.

10、ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) and Jaspar(http://jaspar.genereg.net/)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能的抑制 miR-630轉(zhuǎn)錄的結(jié)合位點(diǎn)；用熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄分析判斷調(diào)控miR-630轉(zhuǎn)錄的核心序列；用染色質(zhì)免疫共沉淀法（CHIP）驗(yàn)證SP1, c-jun與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；用熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄分析探討該核心序列是否能調(diào)控miR-630轉(zhuǎn)錄；用RT-PCR驗(yàn)證SP1, c-jun在miR

11、-630表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮的作用；用Western blot探討SP1, c-jun能否間接上調(diào)miR-630的靶基因Slug。從功能學(xué)回復(fù)實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證TGF-β是抑制miR-630表達(dá)的上游調(diào)控因子。如：用Transwell實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-630逆轉(zhuǎn)TGF-β刺激導(dǎo)致的細(xì)胞遷移，侵襲能力增強(qiáng)；細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，Western blot，RT-PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-630逆轉(zhuǎn)TGF-β刺激導(dǎo)致的上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)果

12、：用濃度為5ng/ml TGF-β培養(yǎng)基處理 Bel7402，HL，PT-PCR檢測(cè)示 miR-630表達(dá)在24小時(shí)內(nèi)呈時(shí)間依賴性降低；用TGF-βSmad，non-Smad信號(hào)通路抑制劑配合TGF-β聯(lián)合處理細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果檢測(cè)示Erk，JNK，P38信號(hào)通路抑制劑可上調(diào)miR-630表達(dá)；NCBI和Jaspar數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示miR-630轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1kb堿基序列包含多個(gè) Erk，JNK，P38信號(hào)通路下游細(xì)胞因子結(jié)合位點(diǎn)

13、；熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄分析檢測(cè)示miR-630轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游79bp為調(diào)控miR-630轉(zhuǎn)錄的重要序列；染色質(zhì)免疫共沉淀法（CHIP）驗(yàn)證結(jié)果示：該79bp可結(jié)合SP1，c-jun，其分別為Erk，JNK信號(hào)通路下游細(xì)胞因子；熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄分析再次驗(yàn)證該79bp為為調(diào)控miR-630轉(zhuǎn)錄的重要序列，并且SP1，c-jun結(jié)合位點(diǎn)為阻遏蛋白結(jié)合序列；RT-PCR結(jié)果示：SP1，c-jun在TGF-β下調(diào)miR-630表達(dá)中起重要作

14、用；Western blot結(jié)果證明抑制SP1，c-jun，能部分逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的Slug表達(dá)上調(diào)； Transwell，劃痕實(shí)驗(yàn)顯示抑制miR-630 mimics能逆轉(zhuǎn)TGF-β導(dǎo)致的遷移，侵襲能力增強(qiáng)；細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，Western blotting，RT-PCR檢測(cè)顯示抑制miR-630 mimics能逆轉(zhuǎn)TGF-β導(dǎo)致的上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化及相關(guān)的標(biāo)記物表達(dá)改變。
　　結(jié)論：TGF-β通過(guò)激活其下游的Erk/SP1，JN