OCT4A選擇性剪接體對(duì)人牙髓干細(xì)胞自我更新能力的調(diào)控作用.pdf

1、利用干細(xì)胞的特性進(jìn)行組織工程修復(fù)缺損器官是再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cell，hDPSCs）取材簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小，是非常有應(yīng)用價(jià)值的組織工程種子細(xì)胞。但研究發(fā)現(xiàn)其數(shù)量較少，體外培養(yǎng)擴(kuò)增能力有限，增殖率低于胚胎干細(xì)胞，難以達(dá)到組織工程所需的細(xì)胞數(shù)量，有報(bào)道體外培養(yǎng)的hDPSCs“干性”特征隨傳代次數(shù)增加而減弱[1]。因此搞清牙髓干細(xì)胞自我更新的調(diào)控機(jī)制，找到調(diào)控其“干性維持”的靶點(diǎn)，將有助于

2、解決牙髓干細(xì)胞應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。
　　我們的前期研究發(fā)現(xiàn)OCT4轉(zhuǎn)錄因子一個(gè)重要的選擇性剪接體——OCT4A的表達(dá)下調(diào)與hDPSCs體外擴(kuò)增后干性特征降低密切相關(guān)，此外與胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）相比hDPSCs內(nèi)OCT4A表達(dá)量較低，以上結(jié)果提示OCT4A剪接體可能參與調(diào)控hDPSCs自我更新能力。
　　研究證實(shí)OCT4轉(zhuǎn)錄因子作為干細(xì)胞的多能性的標(biāo)記物，參與維持ESCs和成體干細(xì)胞（A

3、dult stem cells，ASCs）的干性特征。其pre-mRNA可被選擇性剪接產(chǎn)生OCT4A、OCT4B、OCT4B1三個(gè)主要亞型，其中OCT4A亞型決定干細(xì)胞的多能性。而TIP110（squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells3）作為一種剪切因子，參與調(diào)節(jié)OCT4A mRNA的剪接。
　　本研究擬利用shRNA和高表達(dá)慢病毒載體研究OCT4A在hDPSCs干

4、性維持中的調(diào)控作用，同時(shí)檢測(cè)hDPSCs內(nèi)TIP110對(duì)OCT4A表達(dá)調(diào)控，并探究TIP110對(duì)hDPSCs增殖、自我更新能力的影響；最后通過(guò)裸鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證OCT4A和TIP110對(duì)hDPSCs的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究通過(guò)TIP110調(diào)節(jié)OCT4A剪接體表達(dá)以調(diào)控hDPSCs多潛能性和自我更新能力奠定基礎(chǔ)，并為研究hDPSCs干性維持機(jī)制以及組織工程臨床應(yīng)用提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法和結(jié)果：
　　1.hD

5、PSCs分離、培養(yǎng)和鑒定
　　采用組織塊聯(lián)合酶消化法成功分離培養(yǎng)hDPSCs，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原及多向分化能力，結(jié)果表明我們已成功分離、培養(yǎng)獲得hDPSCs。
　　2.OCT4A對(duì)hDPSCs自我更新能力的調(diào)控作用
　　體外二維條件下培養(yǎng)hDPSCs，并在P3代細(xì)胞利用shRNA和高表達(dá)慢病毒表達(dá)載體沉默和過(guò)表達(dá)OCT4A，分別檢測(cè)各組間在增殖、分化能力以及克隆形成能力和干性分子表達(dá)的差異。
　　結(jié)果顯示：

6、r>　?。?）通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組增殖能力，發(fā)現(xiàn)沉默OCT4A后hDPSCs的增殖能力被明顯抑制；過(guò)表達(dá)OCT4A后hDPSCs的增殖能力顯著增加。
　　（2）細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)（colony forming unit，CFU）檢測(cè)結(jié)果顯示沉默OCT4A后hDPSCs的克隆形成能力降低；而過(guò)表達(dá)OCT4A后hDPSCs的克隆形成能力增強(qiáng)。
　　（3）Real-Time PCR檢測(cè)各組hDPSCs中干性分子Klf4、Sox

7、2、Nanog、C-Myc的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在hDPSCs中沉默OCT4A后干性分子表達(dá)水平降低；過(guò)表達(dá)OCT4A則干性分子表達(dá)增強(qiáng)。
　　（4）成脂分化能力檢測(cè)結(jié)果顯示，油紅O染色后鏡下觀察可見(jiàn)沉默OCT4A后實(shí)驗(yàn)組中形成的脂滴明顯少于對(duì)照組；Real-Time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沉默OCT4A后實(shí)驗(yàn)組中PPARγ的表達(dá)受到了明顯抑制；而過(guò)表達(dá)OCT4A可增加hDPSCs脂滴形成同時(shí)伴有成脂基因PPARγ的表達(dá)上調(diào)。
　　（5）礦化

8、能力檢測(cè)結(jié)果顯示，茜素紅染色后肉眼觀可見(jiàn)沉默OCT4A后實(shí)驗(yàn)組染色強(qiáng)度明顯弱于對(duì)照組，過(guò)表達(dá)OCT4A后實(shí)驗(yàn)組染色強(qiáng)度明顯強(qiáng)于對(duì)照組；Real-Time PCR和顯微鏡觀察可見(jiàn)沉默OCT4A可抑制鈣化結(jié)節(jié)的形成及成骨/成牙相關(guān)基因DSPP、BSP、OCN、ALP的表達(dá)；而過(guò)表達(dá)OCT4A則可促進(jìn)hDPSCs鈣結(jié)節(jié)的形成和ALP、DSPP、OCN和BSP的表達(dá)。
　　體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)顯示將hDPSCs礦化誘導(dǎo)2周后接種于羥基磷灰石（HA

9、-TCP）支架材料上，植入裸鼠體內(nèi)8周，Masson及免疫組化染色結(jié)果顯示沉默OCT4A后可抑制hDPSCs成骨/成牙向分化，過(guò)表達(dá)OCT4A則可促進(jìn)成骨/成牙向分化，體內(nèi)與體外結(jié)果一致。
　　3.TIP110對(duì)hDPSCs自我更新能力的調(diào)控作用
　　在hDPSCs中沉默TIP110后檢測(cè)各組間增殖、分化、克隆形成能力和干性分子之間的差異。
　　結(jié)果顯示：
　?。?）Real-Time PCR檢測(cè)沉默TIP110

10、后hDPSCs中干性分子表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)沉默TIP110后 Klf4、Sox2、Nanog、C-Myc表達(dá)受到抑制。
　?。?）CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默TIP110后hDPSCs的增殖能力顯著降低。
　?。?）CFU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默TIP110后實(shí)驗(yàn)組中hDPSCs形成的克隆數(shù)目明顯少于對(duì)照組，表明沉默TIP110可抑制hDPSCs克隆形成能力。
　?。?）體外二維條件下誘導(dǎo)各組hDPSCs向成骨/成牙和成脂分化，通過(guò)

11、茜素紅和油紅O染色及Real-Time PCR檢測(cè)成骨/成牙及成脂相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)沉默TIP110后可明顯抑制hDPSCs的分化能力。
　　（5）Real-Time PCR檢測(cè)沉默TIP110后hDPSCs中OCT4剪接體（OCT4A,OCT4B和OCT4B1）表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)沉默TIP110后 OCT4A表達(dá)受到抑制，而OCT4B和OCT4B1表達(dá)無(wú)明顯改變。
　　綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)OCT4A在hDPSCs干性維持中發(fā)揮