SIRT1的選擇性剪接變異體參與大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分化研究.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)干細(xì)胞是分布于神經(jīng)系統(tǒng)的、具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，能生成多種神經(jīng)細(xì)胞。由于其免疫原性低又具有良好的遷移性能，被廣泛用于神經(jīng)損傷后再生與修復(fù)領(lǐng)域。神經(jīng)干細(xì)胞具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，但其分化受到多種因素影響，包括細(xì)胞外環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)素、細(xì)胞因子、信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子等。而在神經(jīng)損傷以及神經(jīng)退行性疾病的局部微環(huán)境中，神經(jīng)干細(xì)胞往往分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，如何控制神經(jīng)干細(xì)胞在特定環(huán)境下分化為

2、預(yù)期的終末細(xì)胞是待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator2 homolog1, SIRT1)是一種NAD+依賴(lài)的脫乙酰基酶，通過(guò)對(duì)組蛋白及多種非組蛋白進(jìn)行去乙?；揎梾⑴c細(xì)胞衰老、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞糖脂代謝等重要的生理過(guò)程。已有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用，但有關(guān)其調(diào)控方向的研究結(jié)果不一致。例如，研究顯示誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化后S

3、IRT1水平顯著下降，過(guò)表達(dá)SIRT1使神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化減少；但也有研究指出抑制SIRT1使神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力顯著提高。因此，有關(guān)SIRT1與神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程的研究現(xiàn)狀是，SIRT1具有調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用，但究竟是神經(jīng)干細(xì)胞分化的促進(jìn)因子還是抑制因子，目前尚沒(méi)有統(tǒng)一結(jié)論。
　　選擇性剪接(Alternative Splicing，AS)是指mRNA前體(Pre-mRNA)通過(guò)選擇不同剪接位點(diǎn)的組合，剪切掉不同的內(nèi)

4、含子或外顯子，將同一基因中的外顯子以不同的組合方式產(chǎn)生不同的成熟mRNA分子。不同的mRNA選擇性剪接異構(gòu)體可以進(jìn)一步翻譯成功能不同或互相拮抗的蛋白質(zhì)，或者在相同的細(xì)胞由于表達(dá)水平的不同導(dǎo)致不同的表型。不同的選擇性剪接變異體在具體的細(xì)胞功能活動(dòng)中可能是相互獨(dú)立或共同發(fā)揮作用。近年研究顯示SIRT1存在選擇性剪接，如人的SIRT1已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種選擇性剪接變異體，分別是缺失第8外顯子的SIRT1-△Exon8和缺失第2至第9外顯子的SIRT1

5、-△Exon2/9，這兩種不同的選擇性剪接變異體各自發(fā)揮特定的功能，明顯區(qū)別于SIRT1-FL在細(xì)胞中發(fā)揮的功能。
　　已知SIRT1廣泛分布于大鼠神經(jīng)系統(tǒng)，而SIRT1的選擇性剪接變異體是否也存在于此尚不清楚；如果存在，其選擇性剪接變異體的功能是什么以及它是否參與了神經(jīng)干細(xì)胞的分化呢。我們推測(cè)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)可能存在SIRT1的選擇性剪接變異體，也許正是之前忽略了SIRT1選擇性剪接的存在，才導(dǎo)致了SIRT1在神經(jīng)干細(xì)胞分化中矛盾結(jié)

6、論的產(chǎn)生，即SIRT1選擇性剪接的存在可能為之前有關(guān)SIRT1作用的矛盾觀(guān)點(diǎn)提供一個(gè)合理的解釋。
　　目前有關(guān)SIRT1選擇性剪接的研究多數(shù)集中在小鼠和人源細(xì)胞。大鼠是僅次于小鼠的最常用的實(shí)驗(yàn)哺乳動(dòng)物，已知SIRT1廣泛分布于大鼠神經(jīng)系統(tǒng)，探討大鼠SIRT1是否存在選擇性剪接將為后續(xù)研究選擇性剪接變異體的生理、病理功能奠定基礎(chǔ)。SIRT1基因在哺乳動(dòng)物高度保守，而由于種屬差異，大鼠的SIRT1基因與人類(lèi)并不完全相同。通過(guò)基因比對(duì)，

7、我們推測(cè)大鼠的SIRT1基因很有可能缺失第7外顯子，即產(chǎn)生SIRT1-△Exon7。因此，本研究首先觀(guān)察大鼠神經(jīng)系統(tǒng)是否存在SIRT1-△Exon7，其次比較SIRT1的全長(zhǎng)(SIRT1-FL)和SIRT1的選擇性剪接變異體(SIRT1-△Exon7)在海馬(神經(jīng)干細(xì)胞的來(lái)源部位)和皮層(成熟神經(jīng)細(xì)胞的富集部位)這兩個(gè)部位的表達(dá)差異，為SIRT1-△Exon7是否參與神經(jīng)干細(xì)胞的分化提供初步的探索；再通過(guò)比較SIRT1-FL和SIRT1

8、-△Exon7在神經(jīng)干細(xì)胞分化前后的表達(dá)變化和酶活性差異，進(jìn)一步明確SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7在神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。
　　方法：
　　1、PCR檢測(cè)SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7：取新生SD大鼠的大腦組織，分離海馬與皮層。提取總RNA，普通反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)SIRT1-FL和選擇性剪接變異體SIRT1-△Exon7的表達(dá)。然后再應(yīng)用RT-PCR方法分別檢測(cè)SIRT1-FL和SIRT1-△Ex

9、on7在海馬與皮層這兩個(gè)部位的表達(dá)。
　　2、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及誘導(dǎo)分化：采用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)法，新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖形成懸浮的神經(jīng)球后，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，檢測(cè)其標(biāo)記性蛋白巢蛋白(Nestin)的表達(dá)。再用含有10％胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化，隨后分別用神經(jīng)元特異性的微管相關(guān)蛋白β-Tubulin抗體和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary ac

10、idic protein, GFAP)抗體行免疫熒光染色，鑒定已經(jīng)分化的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。
　　3、RT-PCR檢測(cè)SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7：應(yīng)用RT-PCR方法，檢測(cè)增殖的神經(jīng)球和神經(jīng)球誘導(dǎo)分化后SIRT1-FL和SIRT1-△Exon7的mRNA含量。
　　4、SIRT1酶活性檢測(cè)：用SIRT1活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)神經(jīng)球分化前后SIRT1去乙酰化酶活性的變化。
　　結(jié)果：
　　1、SIRT1-

11、△Exon7和SIRT1-FL的mRNA在大鼠海馬和皮層均有表達(dá)；
　　2、海馬SIRT1-△Exon7的mRNA水平比SIRT1-FL低62.02%( P<0.05)，皮層SIRT1-△Exon7的mRNA水平比SIRT1-FL低83.33%( P<0.05)；皮層SIRT1-FL mRNA含量比海馬高5.81%(P<0.05)，而皮層SIRT1-△Exon7的含量比海馬低56.68%( P<0.05)；
　　3、神經(jīng)干細(xì)

12、胞分化前的SIRT1-△Exon7的mRNA水平比SIRT1-FL低44.12%( P<0.05)，分化后SIRT1-△Exon7的mRNA水平比SIRT1-FL低74.62%( P<0.05)；神經(jīng)干細(xì)胞分化后的SIRT1-FL mRNA含量較分化前增高30.21%，SIRT1-△Exon7的mRNA含量較分化前降低41.02%(P<0.05)；分化后總的SIRT1去乙?；富钚暂^分化前增高30.08%( P<0.05)。
　　

13、結(jié)論：
　　1、我們首次發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)存在SIRT1-△Exon7；
　　2、SIRT1-△Exon7在海馬和皮層的表達(dá)水平都低于SIRT1-FL，皮層的SIRT1-△Exon7水平低于海馬，而皮層的SIRT1-FL水平高于海馬，間接提示SIRT1-FL可能促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞的分化過(guò)程而SIRT1-△Exon7可能發(fā)揮相反的作用；
　　3、SIRT1-△Exon7在神經(jīng)干細(xì)胞分化前后的表達(dá)水平都低于SIRT1-FL，分

14、化后的SIRT1-△Exon7水平低于分化前，分化后的SIRT1-FL水平高于分化前，這一結(jié)果與海馬和皮層的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，進(jìn)一步明確SIRT1-FL可能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化而SIRT1-△Exon7抑制分化。神經(jīng)干細(xì)胞分化后較分化前相比，總的SIRT1去乙?；富钚陨咚?30.08%)與SIRT1-FL的mRNA含量的升高水平(30.21%)幾乎一致，提示SIRT1-FL可能是通過(guò)增高其去乙?；富钚远龠M(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化；而SIR