日本囊對(duì)蝦CathepsinB基因在卵巢發(fā)育中的表達(dá)研究.pdf

1、日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）是我國(guó)東南沿海重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖種類。對(duì)蝦的性腺發(fā)育一直是研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室已克隆出組織蛋白酶 B（Cathepsin B）的cDNA全長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)該基因在卵巢中特異性表達(dá)。我們采用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）、免疫組織化學(xué)、Western blot、原位雜交等技術(shù)研究了Cathepsin B在日本囊對(duì)蝦卵巢中不同發(fā)育階段的表達(dá)分析。
　　首先采用HE染色，并結(jié)合性腺發(fā)育指數(shù)

2、（gonad-somatic index，GSI）確定日本囊對(duì)蝦卵巢發(fā)育各個(gè)期的卵細(xì)胞的形態(tài)和染色特征，將其劃分為四個(gè)期，分別為卵黃合成前期（previtellogenic oocyte stage），內(nèi)源性卵黃合成期（endogenous vitellogenic oocyte stage），外源性卵黃合成期（ exogenous vitellogenic oocyte stage）和成熟期（mature oocyte stage）。

3、
　　采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，以18S rRNA為內(nèi)標(biāo)基因，檢測(cè)日本囊對(duì)蝦Cathepsin B基因在mRNA水平不同卵巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。結(jié)果顯示，Cathepsin B在卵黃合成前期表達(dá)最高，內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期表達(dá)水平基本一致，而在成熟期表達(dá)水平急劇下降。其中卵黃合成前期與其它三期相比具有顯著性差異（p<0.05），內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期Cathepsin B不具有顯著性差異（p>0.05），而成熟期

4、與前邊三期相比具有顯著性差異（p<0.05）。
　　而Western blot結(jié)果顯示Cathepsin B蛋白在卵黃合成前期表達(dá)量最低，這與實(shí)時(shí)定量結(jié)果不一致，推測(cè) Cathepsin B的控制機(jī)制是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示Cathepsin B蛋白的分子大小要比其理論值要大，推測(cè)Cathepsin B是一個(gè)翻譯后調(diào)控蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和Western blot都顯示Cathepsin B的 m

5、RNA和蛋白表達(dá)在成熟期下調(diào)，這表明Cathepsin B在卵細(xì)胞成熟期的作用可能減弱。
　　原位雜交和免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示Cathepsin B的 mRNA和蛋白質(zhì)都在卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，而且免疫組化顯示 Cathepsin B蛋白首先出現(xiàn)在離卵細(xì)胞的細(xì)胞核最近位置。但在成熟期的皮質(zhì)棒中沒(méi)有檢測(cè)到Cathepsin B的mRNA或蛋白的存在。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Cathepsin B在日本囊對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作