日本囊對蝦早期胚胎轉(zhuǎn)錄組的測序與分析及其POU3基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus),又名日本對蝦,是國內(nèi)外主要海水養(yǎng)殖對蝦品種之一,具有較強(qiáng)抗病力,受到養(yǎng)殖業(yè)者的青睞。然而目前日本囊對蝦的基因組序列信息還比較匱乏,分子遺傳基礎(chǔ)也很薄弱,遺傳育種工作也屬于起步階段,進(jìn)而影響到與之相關(guān)的功能基因的開發(fā)和分子育種的實(shí)踐。因此,本研究擬利用新一代高通量 Illumina測序技術(shù),對日本囊對蝦早期胚胎(原腸胚時(shí)期)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,通過對高質(zhì)量序列的拼接組裝以及功能基因的

2、注釋和分類,發(fā)掘與生長、繁殖、代謝和抗病等相關(guān)性狀的候選基因,從而為后續(xù)研究對蝦功能基因和分子育種實(shí)踐提供有價(jià)值信息。同時(shí),利用RT-PCR技術(shù),對日本囊對蝦轉(zhuǎn)錄因子Mj-POU3進(jìn)行基因克隆和特異性表達(dá)分析,并構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Ptctp-POU3,為進(jìn)一步探究其在細(xì)胞中的表達(dá)和作用奠定了基礎(chǔ)。
　　應(yīng)用 Illumina高通量測序技術(shù),對日本囊對蝦早期胚胎進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序獲得如下結(jié)果:
　　(1)共獲得10

3、8,320,302條高質(zhì)量序列,通過序列拼接得到67183個轉(zhuǎn)錄本(Transcripts)和46661個單基因簇(Unigenes),Transcripts和Unigenes的平均長度分別為1216 bp和910 bp。對日本囊對蝦拼接得到的 Unigenes與 NT、NR、SwissProt和PFAM等公共數(shù)據(jù)庫比對,通過GO注釋結(jié)果對基因進(jìn)行分類,通過KEGG注釋來揭示基因間的聯(lián)系及其參與的體內(nèi)生化代謝網(wǎng)絡(luò)。
　　(2)已從

4、注釋的基因中鑒別出52個調(diào)控日本囊對蝦早期胚胎發(fā)育的生長因子及其受體,找到了 MAPK和 TGF-β信號通路中與生長相關(guān)的11個基因;找到大量與生長、發(fā)育、繁殖、免疫等生產(chǎn)相關(guān)的候選基因,為后續(xù)開展功能基因研究和分子育種實(shí)踐提供有價(jià)值的信息。
　　Mj-POU3是轉(zhuǎn)錄因子POU基因家族的重要成員,可與DNA結(jié)合并在生物個體發(fā)育的各個階段發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本文利用 RT-PCR技術(shù)成功克隆得到日本囊對蝦POU3基因的完整編碼區(qū),全

5、長1194 bp,編碼397個氨基酸。蛋白質(zhì)功能域分析表明, Mj-POU3含有兩個保守的功能域POU-S(特異性結(jié)構(gòu)域)和POU-H(同源結(jié)構(gòu)域)。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),該基因與無脊椎動物的同源性達(dá)到62％以上,與脊椎動物的同源性也達(dá)到55%左右,說明Mj-POU3氨基酸序列十分保守。相較于脊椎動物,與無脊椎動物的同源性更高。
　　本文以日本囊對蝦的基因組DNA為模板,擴(kuò)增得到同樣長度(1194 bp)的Mj-POU3基因,經(jīng)測序