心臟發(fā)育相關(guān)蛋白TMP3在細(xì)胞中表達(dá)的分布研究.pdf

1、心臟發(fā)育過程十分復(fù)雜，人們在研究心臟病的發(fā)病機(jī)理過程中，對其中的一些難題已有了初步的解決方法和成效。但仍有許多問題亟待研究。通過鑒定心臟發(fā)育相關(guān)的調(diào)控因子，鑒定出與其相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)其參與的信號通路，是研究基因功能的有效手段。闡明基因的分子調(diào)控機(jī)制將為研究清楚心臟發(fā)育的機(jī)制及心臟病的診斷等方面提供理論指導(dǎo)。
　　本實驗室前期已克隆出入和斑馬魚TMP3基因的DNA全長，證明TMP3是一個膜蛋白，在心臟中高表達(dá)，敲低斑馬魚TMP3

2、基因?qū)е滦呐K畸形。同時證明TMP3與轉(zhuǎn)運蛋白TMPA4具有相互作用。通過分離膜、核、質(zhì)蛋白的CO-IP實驗，發(fā)現(xiàn)兩者在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核發(fā)生相互作用，提示TMP3蛋白入核，其入核過程可能需要轉(zhuǎn)運蛋白TMPA4的協(xié)助。
　　生物信息學(xué)分析表明，TMP3基因免疫印記編碼的蛋白大小為35kd左右。我們通過免疫印記實驗表明，TMP3蛋白大小約57kd。我們猜測，TMP3作為膜蛋白可能通過某些修飾作用而增加蛋白質(zhì)的大小。我們?nèi)〕审w斑馬魚的心臟，

3、分別提取細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核與細(xì)胞膜蛋白，檢測TMP3蛋白的表達(dá)分布情況。結(jié)果表明，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中有35kd和57kd兩種大小的TMP3蛋白，細(xì)胞核中的TMP3蛋白為57kd。實驗結(jié)果顯示TMP3在細(xì)胞質(zhì)中的57kd條帶背景較深，并且有拖帶現(xiàn)象。經(jīng)分析，可能是提取成體斑馬魚心臟蛋白過程中參雜有斑馬魚血液，去除血液后，背景及拖帶現(xiàn)象明顯消失，但在胞漿中并未顯出TMP3蛋白。蛋白提取方法改良后，TMP3細(xì)胞質(zhì)中有弱的57kd條帶顯出。有趣的是

4、，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在57kd處細(xì)胞膜條帶最亮，細(xì)胞核次之，細(xì)胞質(zhì)最弱。而TMP表達(dá)出的35kd蛋白正好相反，即在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)最強(qiáng)，細(xì)胞膜中表達(dá)最弱。這說明TMP3蛋白分子量的增加是某種特異性修飾的體現(xiàn)。
　　生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，人類TMP3蛋白含有一個糖基化位點，我們構(gòu)建了TMP3糖基化位點突變的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞進(jìn)行免疫印記分析，檢測結(jié)果顯示TMP3蛋白的大小依然是57kd，TMP3蛋白大小的變化與糖基化的關(guān)系正在研究中。