基于疏水蛋白HFBI在煙草中表達Reteplase的研究.pdf

1、急性心肌梗塞、腦梗塞等血栓栓塞性疾病的致殘率和致死率都很高，嚴(yán)重威脅著人類健康及生命。Reteplase是臨床上治療血栓性疾病的常用藥物。當(dāng)前商品化的Reteplase藥物是經(jīng)由大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得的，其表達產(chǎn)物非糖基化，后續(xù)復(fù)性純化的收率不高且價格昂貴。因此，探索和研究新型、高效的表達系統(tǒng)是解決上述問題的關(guān)鍵。本實驗室曾嘗試?yán)脽煵莼ㄈ~病毒（TobaccoMosaicVirus，TMV）載體表達系統(tǒng)在煙草中表達Reteplase。研究

2、結(jié)果表明利用植物作為生物反應(yīng)器表達Reteplase是可行的，但是利用TMV病毒載體表達系統(tǒng)在煙草中表達的Reteplase有嚴(yán)重的降解現(xiàn)象。鑒于此，本研究探索了基于疏水蛋白HFBI在煙草中表達Reteplase的可行性。
　　以GFP為報道基因，首先對HFBI融合表達外源基因的效果和特點進行了研究。利用農(nóng)桿菌滲濾技術(shù)，將GFP-HFBI植物表達載體分別接種本氏煙和普通煙（白肋）植株葉片。通過整株和細胞水平對煙草接種部位熒光信號的

3、比較，從兩個備選表達寄主中選擇本氏煙作為HFBI融合表達外源基因的的宿主植物。整株、細胞和分子（蛋白質(zhì)）水平的比較實驗結(jié)果表明，在整個實驗觀察期內(nèi)，GFP-HFBI的熒光信號/表達量在各個時間段均明顯高于GFP。結(jié)果證明，HFBI的融合表達可以有效地提高外源基因在煙草植物中的表達水平。通過在核酸(mRNA)和蛋白質(zhì)水平對煙草中GFP和HFBI-GFP不同時期表達積累水平同時進行比較分析，推測HFBI是在翻譯水平而不是轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用來提

4、高外源基因在植物煙草中的表達水平。進一步的細胞水平的觀察結(jié)果顯示，HFBI融合表達的GFP煙草葉片細胞中可以看到大量致密的綠色熒光蛋白顆粒，而對照組則觀察不到此現(xiàn)象。認(rèn)為由于HFBI本身具有疏水和易聚集的特性，HFBI融合表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)形成不溶性的聚集物，進而在一定程度上隔絕了宿主細胞內(nèi)源性蛋白酶對表達產(chǎn)物的降解，從而實現(xiàn)外源基因表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的長期持續(xù)積累，通過累積效應(yīng)，外源基因表達水平得到了提高。在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，開展了基

5、于HFBI在煙草中融合表達Reteplase的研究。以普通煙的密碼子使用頻率為標(biāo)準(zhǔn)對Reteplase編碼基因序列進行密碼子優(yōu)化和基因合成，并利用亞克隆技術(shù)構(gòu)建了Reteplase的HFBI植物表達載體。表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和westernblot實驗結(jié)果表明，基于HFBI融合表達可以在本氏煙中表達出Reteplase，其表達量約為5.0μg/g鮮葉。體外生物學(xué)活性實驗顯示，在煙草中表達的Reteplase具有體外溶栓活性，且N末

6、端融合表達的HFBI標(biāo)簽未對Reteplase的生物學(xué)活性產(chǎn)生明顯的影響。綜合實驗結(jié)果和生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，推測在煙草植物中基于HFBI融合高表達GFP（2.5mg/g鮮葉）和低表達Reteplase（5.0μg/g鮮葉）的可能原因兩個，其一是因密碼子的優(yōu)化而產(chǎn)生了潛在的內(nèi)含子剪接位點;其二是Reteplase基因原有的信號肽序列不能被植物正確的識別和切割。
　　研究結(jié)果對深入了解基于HFBI的融合表達，指導(dǎo)其他具有商業(yè)價值的外源