玻璃化凍融后胚胎的質(zhì)量對(duì)其臨床結(jié)局的影響及水通道蛋白在胚胎玻璃化凍融過(guò)程中的表達(dá)和作用.pdf

1、研究背景:
　　隨著輔助生殖技術(shù)(assistedreproductiontechnology,ART)的不斷發(fā)展,冷凍胚胎移植(frozen-thawedembryotransfer,F-ET)已經(jīng)成為輔助生殖領(lǐng)域中不可或缺的組成部分,F-ET周期可有效降低多胎率,很大程度上避免了卵巢過(guò)度刺激綜合征(ovarianhyperstimulationsyndrome,OHSS)的發(fā)生和加重,同時(shí),可以提高單次取卵累積妊娠率,減輕患者

2、的心理和經(jīng)濟(jì)壓力。隨著冷凍胚胎技術(shù)的逐漸成熟,已由傳統(tǒng)的慢速冷凍保存技術(shù)發(fā)展到玻璃化冷凍技術(shù),進(jìn)一步完善玻璃化冷凍技術(shù)和提高胚胎復(fù)蘇率已經(jīng)成為生殖領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)。
　　玻璃化冷凍胚胎實(shí)際上是個(gè)脫水的過(guò)程,而胚胎復(fù)蘇則是細(xì)胞外水分子和小分子物質(zhì)回復(fù)細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程。有研究表明,細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡取決于水分子和冷凍防護(hù)劑在細(xì)胞內(nèi)外的有效跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),而細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡又是成功凍融和復(fù)蘇胚胎的關(guān)鍵所在。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),除了水通道蛋白(Aqua

3、porins,AQPs)外,尚未發(fā)現(xiàn)其他可以介導(dǎo)水轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜蛋白。AQPs是一組參與水轉(zhuǎn)運(yùn)、能維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓穩(wěn)定的跨膜蛋白,廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物的生物膜上。隨著對(duì)AQPs的深入研究,迄今為止,已檢測(cè)出11種AQP亞型(AQP0-10),豐富表達(dá)于哺乳動(dòng)物的生殖系統(tǒng),在生殖生理和病理過(guò)程中扮演著不可或缺的角色。同時(shí)在ART中,對(duì)于優(yōu)化卵子和胚胎冷凍技術(shù),提高冷凍復(fù)蘇率也具有重要意義。
　　本課題將從玻璃化凍融過(guò)程中可能的

4、分子機(jī)制及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)分析兩大方面進(jìn)行研究,首先對(duì)2012年1月至2013年1月在本生殖中心行玻璃化凍融胚胎移植的609個(gè)周期臨床資料進(jìn)行回顧性研究,探討不同質(zhì)量的玻璃化凍融后胚胎對(duì)其臨床結(jié)局的影響,為選擇合適時(shí)期和高質(zhì)量的凍融胚胎移植提供理論依據(jù)。并通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)AQPs在人類早期胚胎上的表達(dá)亞型及分布特征,同時(shí)選取在人類早期胚胎上有高表達(dá)且可能在高滲冷凍防護(hù)劑環(huán)境中發(fā)揮作用的AQP3,對(duì)比玻璃化凍融前后胚胎上AQP3的表達(dá)變化

5、,以探討AQP3在胚胎凍融過(guò)程中可能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　第一部分:玻璃化凍融后胚胎的質(zhì)量對(duì)其臨床結(jié)局的影響
　　研究目的:
　　探討不同質(zhì)量的玻璃化凍融后胚胎移植對(duì)其臨床結(jié)局的影響,為選擇合適時(shí)期和高質(zhì)量的凍融胚胎移植提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　收集2012年1月至2013年1月期間廣東省婦幼保健院生殖中心609個(gè)行玻璃化冷凍胚胎周期且均為移植2枚凍融后胚胎的臨床資料。根

6、據(jù)凍融后裂解期胚胎的卵裂球數(shù)目、胚胎的發(fā)育時(shí)期及胚胎的完整性的不同分別進(jìn)行分組,分析三者對(duì)臨床結(jié)局的影響。研究結(jié)果采取SPSS18.0的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,年齡、內(nèi)膜厚度組間比較采取T檢驗(yàn),組間率之間的比較均采取行×列列表資料的χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異有顯著性。
　　研究結(jié)果:
　　(1)移植卵裂期不同卵裂球數(shù)目的凍融后胚胎對(duì)臨床結(jié)局的影響
　　根據(jù)玻璃化凍融復(fù)蘇后卵裂期胚胎的卵裂球數(shù)目分為三組:A組:細(xì)胞數(shù)為4-7

7、的胚胎組;B組:細(xì)胞數(shù)為8的胚胎組;C組:細(xì)胞數(shù)為9-14的胚胎組。結(jié)果如下:三組的年齡和移植當(dāng)日內(nèi)膜厚度的兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);A組的胚胎種植率、臨床妊娠率顯著低于B組和C組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);C組的胚胎種植率、多胎率、流產(chǎn)率和臨床妊娠率均高于B組,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　(2)移植不同時(shí)期的凍融后胚胎對(duì)臨床結(jié)局的影響
　　根據(jù)玻璃化凍融復(fù)蘇后繼續(xù)培養(yǎng)后移植不同時(shí)期的胚

8、胎分為三組,A1組:卵裂期胚胎組(細(xì)胞數(shù)8-14個(gè));B1組:桑椹胚組;C1組:囊胚組,每組胚胎都由卵裂期胚胎冷凍-解凍繼續(xù)培育而成。結(jié)果顯示:三組的年齡和移植當(dāng)日內(nèi)膜厚度的兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);A1組的胚胎種植率、臨床妊娠率及多胎率均低于其余兩組,其中種植率和多胎率的比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),臨床妊娠率的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);C1組的臨床妊娠率和多胎率高于B1組,種植率低于B1組,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義(P>0.05);三組流產(chǎn)率的比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　(3)移植凍融后胚胎的完整性對(duì)臨床結(jié)局的影響
　　根據(jù)玻璃化凍融后胚胎是否完整分為兩組:A2組:完整胚胎組;B2組:非完整胚胎組。結(jié)果顯示:兩組的年齡和移植當(dāng)日內(nèi)膜厚度的比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);A2組的胚胎種植率和臨床妊娠率顯著高于B2組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A2組的多胎率和流產(chǎn)率高于B2組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0

10、.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.臨床上選取移植玻璃化凍融復(fù)蘇后卵裂期胚胎盡可能包含1枚8-14細(xì)胞的胚胎。
　　2.移植復(fù)蘇后不同時(shí)期的胚胎應(yīng)根據(jù)患者子宮內(nèi)膜環(huán)境和胚胎的發(fā)育情況共同決定。
　　3.玻璃化凍融后非完整胚胎的發(fā)育潛能低下,對(duì)其臨床結(jié)局有較大的影響。
　　第二部分:水通道蛋白在人類早期胚胎上的表達(dá)
　　研究目的:
　　明確AQP1、AQP3、AQP7、AQP8四種AQP亞型在人類

11、早期胚胎上的表達(dá)情況,探討AQPs在人類早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的可能機(jī)制。
　　研究方法:
　　收集2012年1月至2013年1月在廣東省婦幼保健院生殖中心體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET)和單精子卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)術(shù)后第3天(D3)廢棄2PN胚胎(細(xì)胞數(shù)≤4個(gè),細(xì)胞碎片<50％)、異

12、常受精1PN和3PN胚胎(細(xì)胞數(shù)≥6個(gè),細(xì)胞碎片<50%)及第6天(D6)由廢棄胚胎孵育出的囊胚作為研究對(duì)象。采取免疫熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)人類早期胚胎分別進(jìn)行AQP1、AQP3、AQP7、AQP8表達(dá)的定性檢測(cè)。
　　研究結(jié)果:
　　在人類胚胎各個(gè)發(fā)育時(shí)期均可見AQP3綠色熒光信號(hào),在卵裂期主要定位于卵裂球的胞核,胞質(zhì)和胞膜可見熒光信號(hào),在囊胚期綠色熒光信號(hào)定位于囊胚腔和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)細(xì)胞層胞核、胞質(zhì)、胞膜處;在卵裂期1PN和3P

13、N胚胎及囊胚階段均見AQP7熒光信號(hào),均質(zhì)分布于卵裂球的胞核、胞質(zhì)和胞膜處,而在囊胚上主要定位于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胞核處;AQP8綠色熒光信號(hào)僅見于囊胚,定位于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞的胞核、胞質(zhì)及胞膜上;AQP1在胚胎各個(gè)階段均未見綠色熒光的表達(dá)。
　　研究結(jié)論:
　　1.AQP3、AQP7、AQP8在人類早期胚胎中有陽(yáng)性表達(dá),且與其在小鼠胚胎上的分布有一定區(qū)別,提示AQPs與人類早期胚胎潛能存在密切關(guān)系;
　　2.不同的AQP亞

14、型表達(dá)的時(shí)期和部位可隨各個(gè)發(fā)育時(shí)期發(fā)育的需要相應(yīng)調(diào)節(jié),提示AQPs對(duì)人類早期胚胎的發(fā)育起著積極的調(diào)控作用。
　　第三部分:水通道蛋白3在人類早期胚胎玻璃化凍融前后的分布和表達(dá)變化情況
　　研究目的:
　　比較AQP3在人類早期卵裂期和囊胚期胚胎玻璃化凍融前后的分布特征及表達(dá)變化情況,以探討AQP3在人類胚胎凍融前后可能發(fā)揮的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　研究方法:
　　收集2012年1月至2013年1月在廣東省婦幼

15、保健院生殖中心行IVF-ET和ICSI術(shù)后D3異常受精1PN和3PN胚胎(細(xì)胞數(shù)≥6個(gè),細(xì)胞碎片<50%)及D6由廢棄胚胎孵育出的囊胚作為研究對(duì)象。對(duì)這兩組胚胎分別進(jìn)行玻璃化冷凍-解凍復(fù)蘇。采取免疫熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)玻璃化凍融-解凍復(fù)蘇后胚胎和收集的同期新鮮胚胎進(jìn)行AQP3表達(dá)的定性檢測(cè)。應(yīng)用蛋白印跡(westernblot)技術(shù)對(duì)新鮮胚胎和同期玻璃化凍融復(fù)蘇后胚胎上AQP3蛋白表達(dá)量的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,westernblot以GAPDH

16、條帶作為內(nèi)參對(duì)樣本蛋白量進(jìn)行校正,結(jié)果利用ImagePlus6.0圖像軟件進(jìn)行分析,均取平均值進(jìn)行計(jì)算,采取SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　(1)免疫熒光檢測(cè)
　　在新鮮卵裂期胚胎上,AQP3綠色熒光信號(hào)主要分布在卵裂球的胞核,胞質(zhì)胞膜次之;新鮮囊胚期綠色熒光主要集中在囊胚腔和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)細(xì)胞層胞核、胞質(zhì)、胞膜處。冷凍復(fù)蘇后,卵裂期胚胎綠色熒光信號(hào)均質(zhì)的分布

17、于卵裂球的胞核、胞質(zhì)及胞膜;囊胚期綠色熒光集中于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)胞核及滋養(yǎng)細(xì)胞層胞核,胞質(zhì)及胞膜可見綠色熒光。
　　(2)westernblot
　　新鮮囊胚期胚胎AQP3蛋白表達(dá)量高于新鮮卵裂期胚胎,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);冷凍復(fù)蘇后,檢測(cè)到囊胚期AQP3蛋白含量也高于卵裂期,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在卵裂期和囊胚期,凍融復(fù)蘇后胚胎AQP3蛋白表達(dá)量均低于新鮮胚胎,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。