PVA與可視化DSC用于玻璃化凍存技術的實驗研究.pdf

1、冰晶的形成是導致生物材料在低溫冷凍保存過程中遭受冷凍損傷的重要原因，因此控制冰晶形成對低溫冷凍保存技術研究具有非常重要的作用。玻璃化法是目前最有效的冷凍保存方法，它可以避免因結冰對細胞造成的破壞作用。通常情況下，玻璃化法需要使用較高濃度的玻璃化溶液，然而這種高濃度的溶液又會對細胞產(chǎn)生毒性作用，因此，通過使用具有防凍活性的物質來抑制冰晶形成，降低玻璃化所需濃度，將是解決這一問題的有效途徑。目前，這種防凍活性物質主要有天然大分子防凍蛋白(A

2、FPs)、防凍糖蛋白(AFGPs)以及人工合成大分子聚乙烯醇(PVA)、聚丙三醇(PGL)等。其中，PVA具有與AF(G)Ps相似的防凍活性，由于價格低廉，可以批量生產(chǎn)等優(yōu)點，因而是AF(G)Ps的理想替代品。 論文工作中，主要選用PVA作為玻璃化溶液添加劑，分別通過如下幾個方面的實驗詳細考察了PVA在玻璃化研究與應用中所具有的效果。 首先利用差示掃描量熱法(DSC)，對添加PVA(0-5％，v/w)的丙二醇(PG)和二

3、甲基亞砜(DMSO)玻璃化水溶液進行了熱分析實驗，結果表明，PVA在玻璃化溶液中不僅對冰晶成核有抑制作用，對冰晶生長也有抑制作用，主要體現(xiàn)在降溫階段，PVA能增加溶液過冷，并使最終形成的玻璃態(tài)中自由水含量增加；在升溫階段，PVA能夠使反玻璃化和重結晶延遲。 以PVA(0-1％，w/w)為添加劑，采用凍結濃縮的蔗糖—水玻璃體系為模型，利用DSC研究PVA對玻璃態(tài)松弛行為的影響。結果表明，PVA能夠減緩玻璃態(tài)的結構松弛，使玻璃態(tài)的穩(wěn)

4、定性增加，表現(xiàn)在相同的老化時間下，玻璃化轉變處熱焓的恢復峰隨PVA濃度增大而減小。另外，隨PVA濃度增大，玻璃態(tài)的松弛過程傾向于減慢的趨勢。 開發(fā)研制了一種具有可視化功能的差示掃描量熱裝置，即可視化DSC。該裝置采用差示掃描量熱法與低溫顯微鏡相結合的測量手段，允許對樣品進行DSC測量的同時能夠對其微觀結構變化進行實時觀察，提高了數(shù)據(jù)獲取的同步性與可靠性。 利用可視化DSC，進一步考察了PVA(0-3％，w/w)在1，2-

5、丙二醇玻璃化溶液中對冰晶成核與生長的作用。其中，溶液的凍結溫度與結晶焓采用DSC進行測量，冰晶在降溫過程的生長狀態(tài)采用顯微鏡攝像系統(tǒng)觀察并記錄，通過冰晶生長的顯微鏡照片分析得到溶液中冰晶份數(shù)隨溫度的變化關系，并利用相圖中的杠桿規(guī)則，描述溶液在凍結濃縮過程中濃度隨溫度的變化關系。結果證明，PVA不僅能夠有效抑制玻璃化溶液中冰晶成核，同時對冰晶生長也有抑制作用。PVA在玻璃化溶液中對冰晶生長抑制的作用機理主要有兩個方面的因素，即質量傳輸與冰

6、晶表面動力學。PVA的高黏度特性，影響溶液中水分子擴散，使質量傳輸成為冰晶生長速率的主控因素。伴隨冰晶生長過程，液相的溶液逐漸濃縮，冰晶生長的速率逐漸減慢，當速率減慢至一個臨界值，約0.1mm/h時，PVA的防凍活性表現(xiàn)出來，體現(xiàn)在冰晶生長速率的驟然下降。 根據(jù)上述實驗結果，優(yōu)化出一種含有PVA的玻璃化凍存液，并將這種凍存液應用于臍血間充質干細胞的冷凍保存實驗研究，其中考察了兩種不同的冷凍復溫方案，即使用可視化DSC進行的程序性

7、慢速冷凍與慢速復溫，以及直接投入液氮快速冷凍與水浴快速復溫。結果表明，采用可視化DSC進行程序慢速冷凍與慢速復溫之后，能夠獲得較多的存活細胞。將冷凍與升溫速率加快，采用直接投入液氮的快速玻璃化凍存與快速水浴復溫，使解凍之后的細胞活率高達95％以上。這表明，即使是在慢速冷凍與慢速復溫過程中，PVA也能發(fā)揮冰晶的抑制作用，從而保護細胞免受損傷。因此采用快速玻璃化凍存與快速復溫之后得到的細胞高活率有其合理性和必然性。此外，利用可視化DSC所得