小干涉RNA沉默效率預(yù)測(cè)和長(zhǎng)非編碼RNA表觀調(diào)控研究.pdf

1、ENCODE計(jì)劃揭示整個(gè)人類基因組的大部分會(huì)被轉(zhuǎn)錄，而其中編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本只占很少一部分，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本是非編碼RNA，如rRNA、tRNA、siRNA、miRNA、piRNA、lncRNA等。它們構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以精細(xì)地調(diào)控基因的表達(dá)。對(duì)這些非編碼RNA的研究重新定義了“基因”的概念。本文以siRNA和lncRNA為研究對(duì)象，研究了影響siRNA的沉默基因效率的因素，分析了表觀遺傳修飾與lncRNA基因表達(dá)的相關(guān)性。
　　

2、RNA干涉是通過沉默特定基因研究基因功能的有力工具，并廣泛應(yīng)用于靶向藥物設(shè)計(jì)，為基因治療提供了新方向。對(duì)于小干涉RNA(siRNA)的設(shè)計(jì)而言，并不是針對(duì)靶基因的每個(gè)位點(diǎn)都具有同樣的抑制效率。所以一個(gè)成功的RNA干涉實(shí)驗(yàn)，選擇最佳沉默效率的小干涉RNA是最關(guān)鍵的一步。許多研究者已經(jīng)總結(jié)了一些篩選原則，并利用各種機(jī)器學(xué)習(xí)算法優(yōu)化siRNA的設(shè)計(jì)，但仍然未達(dá)到令人滿意的效果。預(yù)測(cè)精度的限制主要來源于對(duì)分子機(jī)制缺乏完整的理解。目前所知:siR

3、NA與Argonaute蛋白的結(jié)合是其行使功能的關(guān)鍵。在上游過程中，核苷酸組分和siRNA熱力學(xué)穩(wěn)定性影響著RISC沉默復(fù)合體的組裝，進(jìn)而決定siRNA的沉默效率。而下游過程中，對(duì)靶mRNA的可及性是否影響沉默效率還存有爭(zhēng)議。Reynolds等人的實(shí)驗(yàn)證明siRNA的沉默效率不依賴于靶mRNA的特征屬性，更傾向于受siRNA小分子固有屬性影響。而Luo和Heale有著不同見解，他們認(rèn)為靶mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是沉默效率高低的決定因素，并將其

4、應(yīng)用到siRNA沉默效率的預(yù)測(cè)中。與此同時(shí)，有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持他們的觀點(diǎn)。盡管實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明RNAi是依賴于ATP水解能的多蛋白參與的復(fù)雜過程，但一些細(xì)節(jié)還很模糊，比如RISC是如何尋找靶基因的？尋靶過程是否依賴結(jié)合位點(diǎn)上下文環(huán)境？所以發(fā)現(xiàn)一些潛在的影響因素是一項(xiàng)重要的任務(wù)。
　　近來，已有實(shí)驗(yàn)研究證明當(dāng)miRNA結(jié)合位點(diǎn)處于AU-rich的上下文環(huán)境中，能夠幫助miRNA與靶的結(jié)合;Sun等人認(rèn)為在miRNA結(jié)合位點(diǎn)

5、上游區(qū)域包含一些AU-rich motif,比如ARE(AU-rich elements)的核心序列“AUUUA”，可以增加其抑制蛋白翻譯的效率;Kertesz提出了一個(gè)包含側(cè)翼序列信息的miRNA靶位點(diǎn)識(shí)別模型。但目前還沒有針對(duì)siRNA結(jié)合位點(diǎn)上下文環(huán)境的研究。鑒于siRNA與miRNA分子機(jī)制的相似性，本文重點(diǎn)探討siRNA結(jié)合位點(diǎn)兩側(cè)序列是否影響其沉默效率。這需要大量隨機(jī)設(shè)計(jì)的siRNA作為統(tǒng)計(jì)樣本，一個(gè)針對(duì)34個(gè)基因隨機(jī)設(shè)計(jì)的

6、2431個(gè)siRNA的數(shù)據(jù)庫為我們的研究提供了可能。
　　通過統(tǒng)計(jì)siRNA靶位點(diǎn)側(cè)翼序列核苷酸分布特征發(fā)現(xiàn):相對(duì)而言，高效率siRNA結(jié)合位點(diǎn)側(cè)翼序列更富含AU核苷酸。進(jìn)一步利用二項(xiàng)式分布算法統(tǒng)計(jì)6聯(lián)體motif的偏好性，發(fā)現(xiàn)在高效siRNA結(jié)合位點(diǎn)上下文環(huán)境中偏好出現(xiàn)一些AU-rich motif,同樣包含了“AUUUA”序列。綜合所有影響因素（核苷酸組分、5'端與3'端穩(wěn)定性差異、靶mRNA的可及性、側(cè)翼序列核苷酸分布特征與

7、AU-rich motif偏好性等），我們提出了一個(gè)新穎的兩步算法用于預(yù)測(cè)siRNA效率。這一算法結(jié)合隨機(jī)森林和支持向量機(jī)建立訓(xùn)練模型，去除冗余的信息，選擇最佳特征子集，并能給出每個(gè)特征的貢獻(xiàn)重要性指標(biāo)。在獨(dú)立測(cè)試集上預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示皮爾遜相關(guān)性達(dá)到0.721，而國際知名預(yù)測(cè)算法Biopredsi、i-score、DSIR和ThermoComposition21分別為0.671、0.668、0.645、0.680。對(duì)特征的相關(guān)性分析表明，

8、靶可及性是最重要的指標(biāo)之一。另外，當(dāng)引入靶位點(diǎn)側(cè)翼序列特征后，預(yù)測(cè)率得到顯著提高。這說明siRNA與靶mRNA的相互作用不僅在結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域需要合適的序列組分和結(jié)構(gòu)狀態(tài)，而且受到更寬泛的區(qū)域的影響，甚至可能有更多的RNA結(jié)合蛋白參與此過程。
　　作為生命調(diào)控的新層面，長(zhǎng)非編碼RNA近年來受到廣泛的關(guān)注，它的越來越多的功能也被發(fā)現(xiàn)，比如在基因組印跡、X染色體失活等表觀遺傳修飾通路中起到關(guān)鍵作用。但表觀遺傳修飾對(duì)lncRNA表達(dá)影響的研

9、究相對(duì)較少，我們重點(diǎn)分析了11種組蛋白修飾(H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me3、H3K27me3、H3K36me3、H3K79me2、H4K20me1、H3K9ac、H3K27ac)和一種組蛋白變體H2A.Z以及DNaseI高敏位點(diǎn)等染色質(zhì)特征與lncRNA基因表達(dá)的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)lncRNA與蛋白編碼基因有著相似的規(guī)律:在TSS附近，組蛋白修飾H3K9ac、H3K27ac、H3K79me2、H3