小干涉RNA沉默效率預測和長非編碼RNA表觀調(diào)控研究.pdf

1、ENCODE計劃揭示整個人類基因組的大部分會被轉(zhuǎn)錄，而其中編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本只占很少一部分，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本是非編碼RNA，如rRNA、tRNA、siRNA、miRNA、piRNA、lncRNA等。它們構(gòu)成了復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以精細地調(diào)控基因的表達。對這些非編碼RNA的研究重新定義了“基因”的概念。本文以siRNA和lncRNA為研究對象，研究了影響siRNA的沉默基因效率的因素，分析了表觀遺傳修飾與lncRNA基因表達的相關(guān)性。
　　

2、RNA干涉是通過沉默特定基因研究基因功能的有力工具，并廣泛應(yīng)用于靶向藥物設(shè)計，為基因治療提供了新方向。對于小干涉RNA(siRNA)的設(shè)計而言，并不是針對靶基因的每個位點都具有同樣的抑制效率。所以一個成功的RNA干涉實驗，選擇最佳沉默效率的小干涉RNA是最關(guān)鍵的一步。許多研究者已經(jīng)總結(jié)了一些篩選原則，并利用各種機器學習算法優(yōu)化siRNA的設(shè)計，但仍然未達到令人滿意的效果。預測精度的限制主要來源于對分子機制缺乏完整的理解。目前所知:siR

3、NA與Argonaute蛋白的結(jié)合是其行使功能的關(guān)鍵。在上游過程中，核苷酸組分和siRNA熱力學穩(wěn)定性影響著RISC沉默復合體的組裝，進而決定siRNA的沉默效率。而下游過程中，對靶mRNA的可及性是否影響沉默效率還存有爭議。Reynolds等人的實驗證明siRNA的沉默效率不依賴于靶mRNA的特征屬性，更傾向于受siRNA小分子固有屬性影響。而Luo和Heale有著不同見解，他們認為靶mRNA的二級結(jié)構(gòu)是沉默效率高低的決定因素，并將其

4、應(yīng)用到siRNA沉默效率的預測中。與此同時，有幾個實驗室的實驗結(jié)果也支持他們的觀點。盡管實驗研究已經(jīng)表明RNAi是依賴于ATP水解能的多蛋白參與的復雜過程，但一些細節(jié)還很模糊，比如RISC是如何尋找靶基因的？尋靶過程是否依賴結(jié)合位點上下文環(huán)境？所以發(fā)現(xiàn)一些潛在的影響因素是一項重要的任務(wù)。
　　近來，已有實驗研究證明當miRNA結(jié)合位點處于AU-rich的上下文環(huán)境中，能夠幫助miRNA與靶的結(jié)合;Sun等人認為在miRNA結(jié)合位點

5、上游區(qū)域包含一些AU-rich motif,比如ARE(AU-rich elements)的核心序列“AUUUA”，可以增加其抑制蛋白翻譯的效率;Kertesz提出了一個包含側(cè)翼序列信息的miRNA靶位點識別模型。但目前還沒有針對siRNA結(jié)合位點上下文環(huán)境的研究。鑒于siRNA與miRNA分子機制的相似性，本文重點探討siRNA結(jié)合位點兩側(cè)序列是否影響其沉默效率。這需要大量隨機設(shè)計的siRNA作為統(tǒng)計樣本，一個針對34個基因隨機設(shè)計的

6、2431個siRNA的數(shù)據(jù)庫為我們的研究提供了可能。
　　通過統(tǒng)計siRNA靶位點側(cè)翼序列核苷酸分布特征發(fā)現(xiàn):相對而言，高效率siRNA結(jié)合位點側(cè)翼序列更富含AU核苷酸。進一步利用二項式分布算法統(tǒng)計6聯(lián)體motif的偏好性，發(fā)現(xiàn)在高效siRNA結(jié)合位點上下文環(huán)境中偏好出現(xiàn)一些AU-rich motif,同樣包含了“AUUUA”序列。綜合所有影響因素（核苷酸組分、5'端與3'端穩(wěn)定性差異、靶mRNA的可及性、側(cè)翼序列核苷酸分布特征與

7、AU-rich motif偏好性等），我們提出了一個新穎的兩步算法用于預測siRNA效率。這一算法結(jié)合隨機森林和支持向量機建立訓練模型，去除冗余的信息，選擇最佳特征子集，并能給出每個特征的貢獻重要性指標。在獨立測試集上預測的結(jié)果顯示皮爾遜相關(guān)性達到0.721，而國際知名預測算法Biopredsi、i-score、DSIR和ThermoComposition21分別為0.671、0.668、0.645、0.680。對特征的相關(guān)性分析表明，

8、靶可及性是最重要的指標之一。另外，當引入靶位點側(cè)翼序列特征后，預測率得到顯著提高。這說明siRNA與靶mRNA的相互作用不僅在結(jié)合位點區(qū)域需要合適的序列組分和結(jié)構(gòu)狀態(tài)，而且受到更寬泛的區(qū)域的影響，甚至可能有更多的RNA結(jié)合蛋白參與此過程。
　　作為生命調(diào)控的新層面，長非編碼RNA近年來受到廣泛的關(guān)注，它的越來越多的功能也被發(fā)現(xiàn)，比如在基因組印跡、X染色體失活等表觀遺傳修飾通路中起到關(guān)鍵作用。但表觀遺傳修飾對lncRNA表達影響的研

9、究相對較少，我們重點分析了11種組蛋白修飾(H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me3、H3K27me3、H3K36me3、H3K79me2、H4K20me1、H3K9ac、H3K27ac)和一種組蛋白變體H2A.Z以及DNaseI高敏位點等染色質(zhì)特征與lncRNA基因表達的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)lncRNA與蛋白編碼基因有著相似的規(guī)律:在TSS附近，組蛋白修飾H3K9ac、H3K27ac、H3K79me2、H3