先天性小耳畸形長鏈非編碼RNA和信使RNA的差異表達(dá)分析及調(diào)控關(guān)系的研究.pdf

1、目的:通過對先天性小耳畸形患者的殘耳軟骨與對側(cè)正常耳廓軟骨組織進(jìn)行基因芯片的檢測，篩選出小耳畸形相關(guān)差異表達(dá)的LncRNAs和mRNAs，根據(jù)生物信息學(xué)分析KEGG通路、GO分析等方法對差異表達(dá)的mRNAs進(jìn)行功能注釋和分析。進(jìn)一步篩選出可能與小耳畸形相關(guān)的LncRNAs和mRNAs，并通過qRT-PCR和Western blotting的方法進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，為今后深入研究先天性小耳畸形的分子機(jī)制及其防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:

2、樣本均源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院收治的單側(cè)非綜合征型先天性小耳畸形患者。患耳及正常耳組織均無感染及軟骨炎等征象。樣本均來源于耳再造三期手術(shù)中的廢棄組織，每側(cè)各約100mg,其中正常側(cè)耳廓軟骨組織取自術(shù)中為矯正雙側(cè)顱耳角不對稱所廢棄的部分。本實(shí)驗(yàn)以殘耳軟骨組織為實(shí)驗(yàn)組，正常耳軟骨組織為對照組。
　　通過Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0篩選單側(cè)先天性小耳畸形患者差異表達(dá)的LncRNAs和

3、mRNAs。通過KEGG生物學(xué)通路分析、GO分析等對差異表達(dá)的LncRNAs和mRNAs進(jìn)行功能注釋和預(yù)測，并采用CNC共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖對重點(diǎn)的LncRNAs進(jìn)行編碼-非編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。根據(jù)生物信息學(xué)分析選擇LncRNA-NR_028308、LncRNA-uc003jsd.1及LPL、TNFRSF11B和LncRNA-ENST00000449766及其鄰近編碼蛋白基因Zinc Finger Protein36-Like2(ZF

4、P36L2)兩組基因，通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和Western blotting的方法進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)情況。
　　結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)所用的基因芯片包含30586個(gè)lncRNAs和26109個(gè)mRNAs探針;與正常側(cè)軟骨比較，殘耳軟骨共檢測出差異性表達(dá)LncRNAs共有180條，其中表達(dá)上調(diào)的LncRNAs有74條，表達(dá)下調(diào)的LncRNAs有106條。差異表達(dá)的mRNAs共有515條，其中表達(dá)上調(diào)的mRNAs有101條，表達(dá)下調(diào)的mRNA

5、s有414條。信號通路分析顯示上調(diào)通路有5條，下調(diào)通路有27條，涉及到甘油酯類代謝、破骨細(xì)胞分化、腫瘤生長等通路。在GO分析中，我們的結(jié)果中上調(diào)基因中涉及生物過程的基因有321條，涉及細(xì)胞組件的基因有16條，以及分子功能的基因有41條。下調(diào)基因中涉及生物過程的基因共有553條，涉及細(xì)胞組件的基因有101條，以及分子功能的基因有74條。同時(shí)選擇了15個(gè)LncRNAs和120個(gè)mRNAs構(gòu)建了CNC共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。
　　我們對所選擇的Ln

6、cRNA-NR_028308、LncRNA-uc003jsd.1及LPL、TNFRSF11B和LncRNA-ENST00000449766及ZFP36L2兩組基因，通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)和Western blotting的方法進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)情況。與對照組驗(yàn)證結(jié)果顯示，qRT-PCR方法驗(yàn)證的兩組LncRNAs和mRNAs基因表達(dá)均上調(diào)，P值小于0.05，與芯片結(jié)果一致。用Western blotting法檢測差異表達(dá)基因蛋白水平的表

7、達(dá)，結(jié)果顯示與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組軟骨組織中與對照組相比LPL、TNFRSF11B和ZFP36L2基因表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:先天性小耳畸形在相同遺傳背景下殘耳軟骨與正常耳廓軟骨組織之間lncRNAs和mRNAs的表達(dá)存在明顯的差異，這些lncRNAs及mRNAs可能通過某些信號通路在小耳畸形發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。LncRNA-NR_028308、LncRNA-uc003jsd.1及LPL、TNFRSF11B和LncRNA-ENS