與NbnCNS-del小鼠小腦發(fā)育缺陷相關的長鏈非編碼RNA的鑒定與分析.pdf

1、奈美亨氏綜合癥(Nijmegen breakage syndrome，NBS)，是人類罕見的染色體斷裂綜合征，由NBS1基因的多型性突變引起，常累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)導致患者頭小畸形。中樞神經(jīng)特異性敲除Nbn基因的小鼠，具有類似NBS患者頭小畸形的表型，其小腦發(fā)育缺陷尤為明顯。為了鑒定新的參與Nbn缺失導致小腦功能缺陷的長非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），并研究其對小腦發(fā)育的影響，我們利用芯片技術分析野生型（

2、NbnCNS-ctr）及Nbn神經(jīng)元特異性敲除（NbnCNS-del）小鼠小腦中l(wèi)ncRNA的表達差異;利用實時定量PCR技術對芯片結果加以驗證;針對目的lncRNA，檢測其全身表達及小腦發(fā)育過程中的表達模式;利用小腦原代培養(yǎng)細胞及P19/Neuro2a細胞系分析該基因的細胞內(nèi)定位，及對母基因的表達調(diào)控模式和（或）對神經(jīng)細胞分化的影響。
　　研究結果表明，長鏈非編碼RNA Gm15577由Negr1基因（Neuronal grow

3、thregulator1）內(nèi)部的內(nèi)含子區(qū)反向轉(zhuǎn)錄而成，特異性表達于小腦，且在小腦發(fā)育過程中呈動態(tài)變化趨勢，而Nbn缺失之后Gm15577整體表達水平顯著降低;同時與未分化期比較，分化后的體外小腦神經(jīng)前體細胞Gm15577及其母基因Negr1均有顯著升高;Gm15577敲低之后導致Negr1以及小腦增殖分化相關因子Shh與β-catenin在RNA水平的表達顯著下調(diào);人髓母細胞瘤臨床樣本數(shù)據(jù)分析表明NEGR1基因在正常人群與腫瘤患者之間有

4、顯著的表達差異。
　　同時研究發(fā)現(xiàn)，1700020I14Rik定位于細胞漿中，有較高的物種保守性，在小腦中表達含量最為豐富;在體外小腦神經(jīng)前體細胞分化過程中，1700020I14Rik與神經(jīng)元標記物βⅢ-tubulin的表達模式一致;并且在RA誘導的P19細胞向神經(jīng)細胞分化的過程中表現(xiàn)出促進細胞分化的作用;此外，1700020I14Rik的第三個外顯子中最保守的一段長為196 nt的序列上預測到多個miRNA靶向結合位點，這可能與

5、1700020I14Rik發(fā)揮生物學功能的機制相關。
　　綜上所述，本研究從神經(jīng)特異性敲除Nbn基因小鼠模型出發(fā)，首次報道了兩個新的與小鼠小腦發(fā)育相關的lncRNA Gm15577和1700020I14Rik。初步研究結果表明Gm15577通過調(diào)控Negr1進而影響小腦神經(jīng)元增殖與分化進程中的Shh與β-catenin信號通路，其基因行為異常有可能與髓母細胞瘤發(fā)病有一定的相關性;1700020I14Rik參與神經(jīng)元前體細胞分化過程