與NbnCNS-del小鼠小腦發(fā)育缺陷相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA的鑒定與分析.pdf

1、奈美亨氏綜合癥(Nijmegen breakage syndrome，NBS)，是人類(lèi)罕見(jiàn)的染色體斷裂綜合征，由NBS1基因的多型性突變引起，常累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致患者頭小畸形。中樞神經(jīng)特異性敲除Nbn基因的小鼠，具有類(lèi)似NBS患者頭小畸形的表型，其小腦發(fā)育缺陷尤為明顯。為了鑒定新的參與Nbn缺失導(dǎo)致小腦功能缺陷的長(zhǎng)非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），并研究其對(duì)小腦發(fā)育的影響，我們利用芯片技術(shù)分析野生型（

2、NbnCNS-ctr）及Nbn神經(jīng)元特異性敲除（NbnCNS-del）小鼠小腦中l(wèi)ncRNA的表達(dá)差異;利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)芯片結(jié)果加以驗(yàn)證;針對(duì)目的lncRNA，檢測(cè)其全身表達(dá)及小腦發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式;利用小腦原代培養(yǎng)細(xì)胞及P19/Neuro2a細(xì)胞系分析該基因的細(xì)胞內(nèi)定位，及對(duì)母基因的表達(dá)調(diào)控模式和（或）對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化的影響。
　　研究結(jié)果表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA Gm15577由Negr1基因（Neuronal grow

3、thregulator1）內(nèi)部的內(nèi)含子區(qū)反向轉(zhuǎn)錄而成，特異性表達(dá)于小腦，且在小腦發(fā)育過(guò)程中呈動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，而Nbn缺失之后Gm15577整體表達(dá)水平顯著降低;同時(shí)與未分化期比較，分化后的體外小腦神經(jīng)前體細(xì)胞Gm15577及其母基因Negr1均有顯著升高;Gm15577敲低之后導(dǎo)致Negr1以及小腦增殖分化相關(guān)因子Shh與β-catenin在RNA水平的表達(dá)顯著下調(diào);人髓母細(xì)胞瘤臨床樣本數(shù)據(jù)分析表明NEGR1基因在正常人群與腫瘤患者之間有

4、顯著的表達(dá)差異。
　　同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，1700020I14Rik定位于細(xì)胞漿中，有較高的物種保守性，在小腦中表達(dá)含量最為豐富;在體外小腦神經(jīng)前體細(xì)胞分化過(guò)程中，1700020I14Rik與神經(jīng)元標(biāo)記物βⅢ-tubulin的表達(dá)模式一致;并且在RA誘導(dǎo)的P19細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的過(guò)程中表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞分化的作用;此外，1700020I14Rik的第三個(gè)外顯子中最保守的一段長(zhǎng)為196 nt的序列上預(yù)測(cè)到多個(gè)miRNA靶向結(jié)合位點(diǎn)，這可能與

5、1700020I14Rik發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)制相關(guān)。
　　綜上所述，本研究從神經(jīng)特異性敲除Nbn基因小鼠模型出發(fā)，首次報(bào)道了兩個(gè)新的與小鼠小腦發(fā)育相關(guān)的lncRNA Gm15577和1700020I14Rik。初步研究結(jié)果表明Gm15577通過(guò)調(diào)控Negr1進(jìn)而影響小腦神經(jīng)元增殖與分化進(jìn)程中的Shh與β-catenin信號(hào)通路，其基因行為異常有可能與髓母細(xì)胞瘤發(fā)病有一定的相關(guān)性;1700020I14Rik參與神經(jīng)元前體細(xì)胞分化過(guò)程