PCBP2基因座位上長非編碼RNA的篩選與鑒定.pdf

1、長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度大于200 nt，以RNA形式發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)lncRNA與蛋白編碼基因的相對(duì)位置，可分為:正義(sense)、反義(antisense)、雙向(bidirectional)、內(nèi)含子(intronic)、基因間(intergenic)五類。H Y.Chang等人近期總結(jié)了基因組范圍內(nèi)篩選lncRNAs的一般策略，即通過將基因組片段上組蛋白修飾活性數(shù)據(jù)與

2、RNA-seq數(shù)據(jù)相結(jié)合分析，尋找潛在的基因間lncRNAs;進(jìn)而對(duì)lncRNAs的編碼能力進(jìn)行分析，確定它們的非編碼性質(zhì)。上述方法對(duì)尋找基因間lncRNAs比較有效，但對(duì)于編碼基因內(nèi)部與基因同向的正義lncRNAs和內(nèi)含子lncRNAs的篩選卻存在一定的局限性。
　　 選擇性剪接(Alternative Splicing)是產(chǎn)生蛋白質(zhì)功能多樣性的重要途徑之一。以往研究更多關(guān)注編碼基因剪接多樣性，也有相關(guān)研究報(bào)道lncRNAs也

3、存在選擇性剪接。RNA結(jié)合蛋白PCBP2在小鼠和人中均存在由選擇性剪接產(chǎn)生的多種轉(zhuǎn)錄本形式，且在不同的生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。研究報(bào)道該基因9號(hào)外顯子位置有可轉(zhuǎn)錄lncRNA的存在，即T-UC.338，其在肝癌中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，但該區(qū)域是否僅存在T-UC.338一個(gè)非編碼RNA轉(zhuǎn)錄物尚不可知。
　　 本研究即以PCBP2內(nèi)部的9號(hào)外顯子區(qū)域?yàn)檠芯繉?duì)象，探討在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)潛在lncRNAs的生物信息學(xué)分析方法，以及該區(qū)域內(nèi)lnc

4、RNAs發(fā)生多重轉(zhuǎn)錄、剪接的可能。本研究從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(UCSC http://genome.ucsc.edu/)入手，選擇在同一基因座位(PCBP2的9號(hào)外顯子區(qū)，UC.338基因座位)上，由內(nèi)含子區(qū)域轉(zhuǎn)錄、剪接形成的ESTs進(jìn)行鑒定和分析，并根據(jù)同源性分析結(jié)果在人和小鼠中分別進(jìn)行篩選，得到四個(gè)ESTs:人源ESTs HY121526和DB276896，鼠源ESTs BQ917950和BF150035。利用Coding Potenti

5、al Calculater(CPC http://cpc.cbi.pku.edu.cn)進(jìn)行蛋白質(zhì)編碼能力分析，并將CPC分析得分與同基因座位上的對(duì)應(yīng)編碼基因(PCBP2)的CPC分值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，篩選潛在的lncRNAs。其中HY121526、BQ917950和BF150035均顯示非編碼RNA的性質(zhì)。同時(shí)本研究用PCR方法檢測這四個(gè)ESTs以及T-UC.338在不同組織中的表達(dá)譜和在同一組織中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化來排除其為轉(zhuǎn)錄噪音

6、的可能性，最終發(fā)現(xiàn)在人各細(xì)胞系中HY121526的表達(dá)具有一定的細(xì)胞特異性，沒有檢測到DB276896的表達(dá)，人源T-UC.338(H-T-UC.338)的表達(dá)也具有一定的細(xì)胞特異性;在小鼠各組織中BQ917950的表達(dá)不僅具有組織特異性，并且BQ917950在小鼠大腦發(fā)育不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)隨時(shí)間的推移呈明顯下降趨勢(shì)，而BF150035在小鼠各組織中廣泛表達(dá)。鼠源T-UC.338(M-T-UC.338)的表達(dá)也具有組織特異性，在小鼠大腦發(fā)

7、育不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)隨時(shí)間的推移呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。
　　 本研究用RACE和步移的方法驗(yàn)證了H-T-UC.338的全長序列，發(fā)現(xiàn)H-T-UC.338的長度要超出文獻(xiàn)報(bào)道的590bp，并檢測了鼠源M-T-UC.338的全長。本研究分別做了探針，下一步將嘗試用Northern的方法驗(yàn)證各lncRNAs的全長。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，lncRNA很可能通過其所在基因座位上的編碼基因起作用，并具有一定的保守性，雖然H-T-UC.338在肝癌中