長鏈非編碼RNA在兒童急性白血病表達譜及其功能的初步研究.pdf

1、目的：長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）在基因調(diào)控中起重要作用，目前它對兒童急性白血?。ˋcute leukemia，AL）發(fā)病機制的影響尚不清楚。本研究采用微矩陣基因芯片技術(shù)，研究lncRNA在AL患兒和正常兒童表達譜的差異；篩選一個差異最大的lncRNA：AC002454.1，通過基因沉默技術(shù)對其進行功能的初步研究，為探索lncRNA參與兒童AL發(fā)病的分子機制提供新的思路及實驗基礎(chǔ)。
　　

2、方法：
　　1.對初治AL患兒9例，其中急性淋巴細胞性白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)6例，急性髓細胞性白血病(Acute myelocyticleukemia，AML)3例；正常健康兒童9例。分為6個樣本，AL患兒：L1（AML3例）、L2（T-ALL3例）、L3（B-ALL3例），正常對照：C1、C2、C3（各3例）。分別取骨髓/外周血單個核細胞，提取總RNA后進行質(zhì)量測定。合格后雜交合成

3、cDNA，經(jīng)過Microarray基因芯片掃描儀掃描后得到原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計軟件轉(zhuǎn)換后進行統(tǒng)計分析，得到AL患兒與正常對照組之間lncRNA和mRNA的差異表達譜。
　　2.選取兒童AL中表達譜差異大于10倍以上的lncRNA97個，對21例ALL患兒、22例AML患兒及21例正常對照兒童，取骨髓單個核細胞，提取總RNA，并進行引物特異性逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實時熒光定量PCR（Real-time quantitative

4、 polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)，GAPDH做內(nèi)參，循環(huán)閾值(Ct值)比較法進行l(wèi)ncRNA表達定量分析，并與芯片結(jié)果驗證。選其中差異最大的lncRNA：AC002454.1分析其表達量與臨床指標的關(guān)系。
　　3.綜合NCBI RefSeq、UCSC、RNAdb、LncRNAs等數(shù)據(jù)庫資源，對芯片結(jié)果進行Gene Ontology、Pathways等生物信息學分析，并通過計算Pearson

5、相關(guān)系數(shù)建立lncRNA與靶基因的基因網(wǎng)絡(luò)圖。
　　4.選用白血病細胞株K562，NB4作為研究對象，構(gòu)建并轉(zhuǎn)染慢病毒載體下調(diào)AC002454.1表達，分別采用CCK8法、流式細胞儀技術(shù)、Western-blot等實驗觀察其對白血病細胞株增殖、凋亡、周期等生物學行為的影響以及CDK6表達的變化。
　　結(jié)果:
　　1.兒童AL差異表達的lncRNA2409個，其中上調(diào)2倍以上1394個，下調(diào)2倍以上1015個；差異表達的

6、mRNA2331個，其中上調(diào)2倍以上1073個，下調(diào)2倍以上1258個。兒童ALL差異表達的lncRNA1884個，其中上調(diào)2倍以上的1106個，下調(diào)2倍以上的778個；差異表達的mRNA1857個，其中上調(diào)2倍以上905個，下調(diào)2倍以上952個。兒童AML差異表達的lncRNA4289個，其中上調(diào)2倍以上的2215個，下調(diào)2倍以上的2074個；差異表達的mRNA4003個，其中上調(diào)2倍以上1769個，下調(diào)2倍以上2234個。
　

7、　2.qRT-PCR驗證兒童AL差異大于10倍以上lncRNA：ALL組顯著上調(diào)9個
　?。╱c002ehu.1、AC002454.1、uc001guz.2、BC035649、uc001kpt.2、AK123765、NR_026776、NR_027182、ENST00000508489），顯著下調(diào)7個（ENST00000415964、uc010arh.1、ENST00000457799、ENST00000511213、NR_002

8、712、X61079、ENST00000417930）；AML組中顯著上調(diào)12個（AC002454.1、uc002ehu.1、ENST00000509150、uc001guz.2、ENST00000457457、uc001kpt.2、NR_027182、AK123765、BC031319、AK124936、uc003hhv.1、NR_026776），顯著下調(diào)12個（AK027193、AK024584、BC005232、AK094982、

9、uc003ebe.1、ENST00000512129、AF088004、uc002vje.1、uc010arh.1、ENST00000428188、ENST00000457799、ENST00000415964），結(jié)果與芯片一致。AC002454.1相對表達量與AL患兒性別、年齡、初診時WBC計數(shù)、染色體、融合基因、危險度分層、預(yù)后等各項臨床指標，無顯著性差異（P值均>0.05）。初診AL患兒不同免疫分型的AC002454.1相對表達量

10、差異顯著（P<0.05）。
　　3.GO分析顯示，上調(diào)的mRNA：413個參與生物學進程(Biological process)、90個參與細胞組件(Cellular component)、94個參與分子功能(Molecular function)，分別以細胞周期（Cell cycle phase）、細胞內(nèi)（Intracellular part）和催化活性（Catalytic activity）富集程度最高；下調(diào)mRNA：665個

11、參與生物學進程、59個參與細胞組件、118個參與分子功能，分別以免疫反應(yīng)（Immune response），質(zhì)膜（Plasma membrane）和蛋白結(jié)合（Protein binding）富集程度最高。
　　4.Pathway分析顯示，24條基因通路受上調(diào)的mRNA調(diào)控，富集程度最高的是通路是細胞周期（Cell cycle），由26個目的基因組成；32條基因通路受下調(diào)的mRNA調(diào)控，富集程度最高的是通路是造血細胞系（Hemato

12、poietic cell lineage），由23個目的基因組成。
　　5.對表達差異顯著的10個lncRNA基因：ENST00000435695(AC002454.1)、ENST00000509150、NR_027182、AK124936、uc003hhv.1、AK027193、BC005232、ENST00000428188、ENST00000415964、NR_002712，通過計算與目的基因的Pearson相關(guān)系數(shù)(≥0.

13、95)，得到797個目的基因，并共同建立編碼-非編碼基因共表達網(wǎng)絡(luò)(Coding-noncoding gene co-expression network)。
　　6.下調(diào)AC002454.1表達可以抑制白血病細胞株K562和NB4的增殖（P<0.05）、提高細胞凋亡率和延長NB4細胞細胞G2/M期。下調(diào)AC002454.1表達后K562細胞和NB4細胞的CDK6表達水平低于對照組。
　　結(jié)論：
　　1.本研究首次采用

14、lncRNA microarray基因芯片揭示兒童AL異常的lncRNA表達譜，并對明顯表達異常的lncRNA采用qRT-PCR進行驗證，結(jié)果與芯片一致。顯示lncRNA microarray基因芯片檢測是一種理想高效的方法
　　2. AL患兒lncRNA表達與正常兒童存在明顯差異，發(fā)現(xiàn)并確定了一個新的基因：AC002454.1在AL各型患兒中異常高表達，且表達量與AL患兒的免疫分型相關(guān)，可望成為兒童 AL分型和判斷預(yù)后的分子標記

15、物。
　　3.生物信息提示異常表達的lncRNA、mRNA參與整個白血病細胞的多個生命過程及通路，調(diào)節(jié)細胞的轉(zhuǎn)化和惡變，網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制復雜。其本身以及它們參與調(diào)控的通路均有可能成為兒童AL基因干預(yù)治療的新靶點。
　　4.體外功能試驗提示：下調(diào)AC002454.1表達可抑制白血病細胞的增殖能力、影響細胞周期和提高凋亡率；下調(diào)AC002454.1表達可影響CDK6表達，為進一步明確AC002454.1生物學功能、探索lncRNA參