IL-17A在放射性肺損傷中的表達(dá)及其作用的研究.pdf

1、研究背景及意義
　　放射性肺損傷(radiation-inducedlunginjury,RILI)是胸部腫瘤放療后、骨髓移植預(yù)處理及戰(zhàn)時(shí)核輻射常見(jiàn)的并發(fā)癥。數(shù)據(jù)表明，臨床上大約有30％的肺癌病人及10-15％其它胸部腫瘤病人放療后可出現(xiàn)明顯臨床癥狀的放射性肺損傷。即便應(yīng)用目前最為先進(jìn)的適形調(diào)強(qiáng)放療，也難以避免其發(fā)生。由于對(duì)于放射性肺損傷發(fā)生機(jī)制認(rèn)識(shí)的局限性，數(shù)十年來(lái)有關(guān)放射性肺損傷的治療一直沒(méi)有突破性進(jìn)展。臨床上通過(guò)盡可能的縮小

2、照射野或降低靶區(qū)劑量，來(lái)降低放射性肺損傷發(fā)生的可能。然而，腫瘤靶區(qū)劑量的限制，勢(shì)必會(huì)影響腫瘤局控率。近年來(lái)，隨著對(duì)放射性肺損傷的深入研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到放射性肺損傷是由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的多細(xì)胞間的相互作用并維持著放射性肺損傷的全過(guò)程。已有研究證實(shí)，IL-1、IL-6、TGF-β、TNF-α等多種細(xì)胞因子參與了放射性肺損傷的過(guò)程，并發(fā)揮重要作用，而以IL-6、TGF-β、TNF-α為靶點(diǎn)的治療，可以減輕肺損傷的程度。然而，以單一細(xì)胞因子為

3、靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)性治療，效果有限。這似乎說(shuō)明可能還存在其它重要相關(guān)的細(xì)胞因子在放射性肺損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL-17A是新近發(fā)現(xiàn)的一種前炎癥因子，高表達(dá)于各組纖維化相關(guān)疾病的組織器官中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-17A在博來(lái)霉素或二氧化硅誘發(fā)的小鼠肺損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且通過(guò)IL-17A拮抗劑減輕了這種性質(zhì)的肺損傷程度。Wilson等通過(guò)敲除小鼠IL-17A基因，發(fā)現(xiàn)IL-17A（-/-）小鼠化學(xué)性肺炎及纖維化程度明顯弱于IL-17A野生

4、型。基于以上研究，我們推測(cè)IL-17A在放射性肺損傷過(guò)程中，可能也發(fā)揮有重要作用。文獻(xiàn)檢索鮮見(jiàn)IL-17A在放射性肺損傷方面的研究。本課題研究IL-17A在放射性肺損傷不同階段的表達(dá)，目的是為了證實(shí)IL-17A參與并在放射性肺損傷過(guò)程中發(fā)揮有重要作用，從而為防治放射性肺損傷提供一有效靶點(diǎn)。以IL-17A為靶點(diǎn)的放射性肺損傷治療，可能是一個(gè)新的有效的臨床途徑。本研究分為三個(gè)部分進(jìn)行闡述。
　　第一部分
　　研究目的:建立快捷、

5、穩(wěn)定的小鼠放射性肺損傷動(dòng)物模型，并對(duì)其進(jìn)行有效評(píng)價(jià)，為研究放射性肺損傷提供一可靠的平臺(tái)。
　　研究方法:近交系雄性C57BL/6小鼠90只，按照隨機(jī)數(shù)目表法隨機(jī)分為3組:(1)假照射組(n=20只)，佯裝照射，簡(jiǎn)稱(chēng)為Sham組;(2)單純照射A組(n=35只)，非麻醉狀態(tài)，全胸一次性大劑量照射15Gy,簡(jiǎn)稱(chēng)為RT-A組;(3)單純照射B組(n=35只)，非麻醉狀態(tài)，照射20Gy，簡(jiǎn)稱(chēng)為RT-B組。直線(xiàn)加速器照射小鼠后于第1、4、8

6、、16周處死，分別取照射A、B組及假照射組小鼠肺組織，采用H&E、Masson染色法顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化和膠原沉積，并按照Szapiel方法對(duì)放射性肺泡炎及肺纖維化的嚴(yán)重程度進(jìn)行量化。通過(guò)堿水解法測(cè)定羥脯氨酸含量，用于評(píng)估肺組織膠原沉積情況。在生存期方面，將50只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組:(1)Sham組:n=10只;(2)RT-A組:n=20只;(3)RT-B組:n=20只。觀察小鼠16周生存期，生存期分析應(yīng)用Kapla

7、n-Meier法及l(fā)og-ranktest法。
　　研究結(jié)果:小鼠全胸經(jīng)照射后，肺組織經(jīng)過(guò)一系列病理變化，包括:滲出期、增生期及纖維化期。HE染色切片顯示照射8周內(nèi)，肺組織主要是肺泡炎的表現(xiàn):肺泡壁增厚、肺泡腔充血、肺間質(zhì)水腫及毛細(xì)血管擴(kuò)張、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等，且隨時(shí)間延長(zhǎng)肺泡炎程度逐漸加重。Masson染色顯示8周開(kāi)始出現(xiàn)灶狀纖維組織增生，16周時(shí)纖維化病灶更為明顯。按照Szapiel分級(jí)法，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示肺泡炎程度:RT-A、B組

8、均較Sham組嚴(yán)重，且RT-B組肺泡炎重于RT-A組。纖維化程度:RT-A、B組重于Sham組，且RT-B組纖維化程度較RT-A組嚴(yán)重。通過(guò)對(duì)各組小鼠腫組織中羥脯氨酸含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)RT-A、B組小鼠照射后，羥脯氨酸含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，且在病理學(xué)上出現(xiàn)灶狀纖維化的第8周及第16周，羥脯氨酸升高趨勢(shì)尤為明顯。在該時(shí)間點(diǎn)上RT-B明顯高于RT-A組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。小鼠生存時(shí)間方面，假照射組小鼠觀察時(shí)間內(nèi)無(wú)死亡。

9、RT-A組小鼠16周存活率為80％。RT-B組小鼠16周存活率僅為40％。且照射B組小鼠死亡時(shí)間明顯早于照射A組。兩組小鼠存活率差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0241＜0.05)。
　　研究結(jié)論:直線(xiàn)加速器15Gy照射C57BL/6小鼠全胸，可以成功構(gòu)建放射性肺損傷模型，為放射性肺損傷的分子機(jī)制的研究及防治靶點(diǎn)的篩選提供基礎(chǔ)。
　　第二部分
　　研究目的:IL-17A作為新近發(fā)現(xiàn)的前炎癥因子，在炎癥或增殖性疾病中發(fā)揮

10、重要作用。本部分研究旨在對(duì)IL-17A在放射性肺損傷不同階段（肺炎及肺纖維化）的表達(dá)情況及可能發(fā)揮的作用進(jìn)行探討。
　　研究方法:將61只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組:(1)假照射組，簡(jiǎn)稱(chēng)Sham組(n=25);(2)照射組，簡(jiǎn)稱(chēng)RT組（n=36）;各組小鼠分別在觀察時(shí)間點(diǎn)1周、4周、8周、16周處死，并進(jìn)行性病理組織學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)Realtime-PCR方法，檢測(cè)各組肺組織IL-17AmRNA的表達(dá)情況，用2-△

11、△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。并通過(guò)Westernbolt印記和免疫組化的方法，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄后各組肺組織中IL-17A蛋白表達(dá)的情況。
　　研究結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示:小鼠全肺經(jīng)15Gy射線(xiàn)照射后，肺組織IL-17A在不同階段，呈現(xiàn)出不同程度的高表達(dá)。IL-17A陽(yáng)性顆粒顯示在肺泡巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞等細(xì)胞胞漿內(nèi)。real-timePCR結(jié)果顯示:照射后小鼠肺組織IL-17AmRNA均有不同程度的表達(dá)增強(qiáng)，4周時(shí)表

12、達(dá)最為顯著（觀察時(shí)間內(nèi)），8周開(kāi)始下降，16周繼續(xù)下降，但仍高于基線(xiàn)水平。結(jié)合組織學(xué)切片染色結(jié)果，8周內(nèi)放射性肺泡炎程度隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加重，而IL-17表達(dá)量卻在8周時(shí)開(kāi)始下降，提示IL-17A可能在早期放射性肺損傷中作用更為重要。Westernblot半定量檢測(cè)顯示IL-17A蛋白表達(dá)量在肺照射1周后便開(kāi)始抬高，4周最高，此后表達(dá)量開(kāi)始下降。IL-17A蛋白表達(dá)情況，與mRNA結(jié)果基本一致。
　　研究結(jié)論:小鼠全胸照射后，肺組

13、織IL-17AmRNA及蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的升高，與肺泡炎和纖維化形成的時(shí)間基本一致，考慮IL-17A在放射性肺泡炎及肺纖維化過(guò)程中發(fā)揮一定作用。
　　第三部分
　　研究目的:阻斷IL-17A信號(hào)途徑可明顯改善多種炎癥性疾病的轉(zhuǎn)歸。本部分研究旨在探討IL-17A中和抗體對(duì)放射性肺損傷小鼠的保護(hù)作用。
　　研究方法:我們采用直線(xiàn)加速器一次性15Gy劑量照射C57BL/6小鼠全胸，構(gòu)建小鼠肺損傷模型。將135只小鼠隨機(jī)

14、分為四組:①假照射組(Sham，n=30);②照射對(duì)照組（RCgroup，n=35）;③治療組（Treatmentgroup，n=35）;④安慰劑組(placebogroup，n=35)。后二組分別于照射后每月第1，3，7，14天，分別靜脈給予IL-17A中和抗體或同型對(duì)照IgG抗體4μg/鼠。通過(guò)H&E和Masson染色來(lái)評(píng)估小鼠肺組織炎癥改變及膠原沉積情況。按照Aschcroft評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺泡炎、肺纖維化程度進(jìn)行定量分析。支氣管肺泡

15、灌洗液中IL-17A,TGF-β1和IL-6含量采用ELISA的方法測(cè)定。羥脯氨酸含量采用堿水解法測(cè)定。另外，我們采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行小鼠的生存期分析。
　　研究結(jié)果:照射后16周，照射對(duì)照組（RC組）和安慰劑組（Placebo組）小鼠肺組織表現(xiàn)為明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)膠原沉積現(xiàn)象，而治療組（Treatment組）小鼠這些病理學(xué)改變則相對(duì)較輕。Treatment組小鼠Ⅱ～Ⅲ度肺泡炎發(fā)生率(16％)明顯低于RC組(

16、72％)或Placebo組(64％)。纖維化程度方面，各組Aschcroft評(píng)分分別為T(mén)reatment組2.8、RC組5.2、Placebo組4.8。Treatment組小鼠的Aschcroft評(píng)分明顯低于RC組(P＜0.001)或Placebo組(P＜0.001)。Treatment組小鼠支氣管灌洗液中IL-17A，TGF-β和IL-6含量明顯低于RC組及Placebo組(P＜0.01)。小鼠180天死亡率方面，Treatment組