IL-17A在放射性肺損傷中的表達及其作用的研究.pdf

1、研究背景及意義
　　放射性肺損傷(radiation-inducedlunginjury,RILI)是胸部腫瘤放療后、骨髓移植預(yù)處理及戰(zhàn)時核輻射常見的并發(fā)癥。數(shù)據(jù)表明，臨床上大約有30％的肺癌病人及10-15％其它胸部腫瘤病人放療后可出現(xiàn)明顯臨床癥狀的放射性肺損傷。即便應(yīng)用目前最為先進的適形調(diào)強放療，也難以避免其發(fā)生。由于對于放射性肺損傷發(fā)生機制認(rèn)識的局限性，數(shù)十年來有關(guān)放射性肺損傷的治療一直沒有突破性進展。臨床上通過盡可能的縮小

2、照射野或降低靶區(qū)劑量，來降低放射性肺損傷發(fā)生的可能。然而，腫瘤靶區(qū)劑量的限制，勢必會影響腫瘤局控率。近年來，隨著對放射性肺損傷的深入研究，人們逐漸認(rèn)識到放射性肺損傷是由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的多細(xì)胞間的相互作用并維持著放射性肺損傷的全過程。已有研究證實，IL-1、IL-6、TGF-β、TNF-α等多種細(xì)胞因子參與了放射性肺損傷的過程，并發(fā)揮重要作用，而以IL-6、TGF-β、TNF-α為靶點的治療，可以減輕肺損傷的程度。然而，以單一細(xì)胞因子為

3、靶點的實驗性治療，效果有限。這似乎說明可能還存在其它重要相關(guān)的細(xì)胞因子在放射性肺損傷過程中發(fā)揮重要作用。IL-17A是新近發(fā)現(xiàn)的一種前炎癥因子，高表達于各組纖維化相關(guān)疾病的組織器官中。動物實驗證實，IL-17A在博來霉素或二氧化硅誘發(fā)的小鼠肺損傷過程中發(fā)揮重要作用，并且通過IL-17A拮抗劑減輕了這種性質(zhì)的肺損傷程度。Wilson等通過敲除小鼠IL-17A基因，發(fā)現(xiàn)IL-17A（-/-）小鼠化學(xué)性肺炎及纖維化程度明顯弱于IL-17A野生

4、型。基于以上研究，我們推測IL-17A在放射性肺損傷過程中，可能也發(fā)揮有重要作用。文獻檢索鮮見IL-17A在放射性肺損傷方面的研究。本課題研究IL-17A在放射性肺損傷不同階段的表達，目的是為了證實IL-17A參與并在放射性肺損傷過程中發(fā)揮有重要作用，從而為防治放射性肺損傷提供一有效靶點。以IL-17A為靶點的放射性肺損傷治療，可能是一個新的有效的臨床途徑。本研究分為三個部分進行闡述。
　　第一部分
　　研究目的:建立快捷、

5、穩(wěn)定的小鼠放射性肺損傷動物模型，并對其進行有效評價，為研究放射性肺損傷提供一可靠的平臺。
　　研究方法:近交系雄性C57BL/6小鼠90只，按照隨機數(shù)目表法隨機分為3組:(1)假照射組(n=20只)，佯裝照射，簡稱為Sham組;(2)單純照射A組(n=35只)，非麻醉狀態(tài)，全胸一次性大劑量照射15Gy,簡稱為RT-A組;(3)單純照射B組(n=35只)，非麻醉狀態(tài)，照射20Gy，簡稱為RT-B組。直線加速器照射小鼠后于第1、4、8

6、、16周處死，分別取照射A、B組及假照射組小鼠肺組織，采用H&E、Masson染色法顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化和膠原沉積，并按照Szapiel方法對放射性肺泡炎及肺纖維化的嚴(yán)重程度進行量化。通過堿水解法測定羥脯氨酸含量，用于評估肺組織膠原沉積情況。在生存期方面，將50只C57BL/6小鼠隨機分為3組:(1)Sham組:n=10只;(2)RT-A組:n=20只;(3)RT-B組:n=20只。觀察小鼠16周生存期，生存期分析應(yīng)用Kapla

7、n-Meier法及l(fā)og-ranktest法。
　　研究結(jié)果:小鼠全胸經(jīng)照射后，肺組織經(jīng)過一系列病理變化，包括:滲出期、增生期及纖維化期。HE染色切片顯示照射8周內(nèi)，肺組織主要是肺泡炎的表現(xiàn):肺泡壁增厚、肺泡腔充血、肺間質(zhì)水腫及毛細(xì)血管擴張、炎性細(xì)胞浸潤等，且隨時間延長肺泡炎程度逐漸加重。Masson染色顯示8周開始出現(xiàn)灶狀纖維組織增生，16周時纖維化病灶更為明顯。按照Szapiel分級法，統(tǒng)計學(xué)分析顯示肺泡炎程度:RT-A、B組

8、均較Sham組嚴(yán)重，且RT-B組肺泡炎重于RT-A組。纖維化程度:RT-A、B組重于Sham組，且RT-B組纖維化程度較RT-A組嚴(yán)重。通過對各組小鼠腫組織中羥脯氨酸含量測定，發(fā)現(xiàn)RT-A、B組小鼠照射后，羥脯氨酸含量均隨時間延長逐漸升高，且在病理學(xué)上出現(xiàn)灶狀纖維化的第8周及第16周，羥脯氨酸升高趨勢尤為明顯。在該時間點上RT-B明顯高于RT-A組，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。小鼠生存時間方面，假照射組小鼠觀察時間內(nèi)無死亡。

9、RT-A組小鼠16周存活率為80％。RT-B組小鼠16周存活率僅為40％。且照射B組小鼠死亡時間明顯早于照射A組。兩組小鼠存活率差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0241＜0.05)。
　　研究結(jié)論:直線加速器15Gy照射C57BL/6小鼠全胸，可以成功構(gòu)建放射性肺損傷模型，為放射性肺損傷的分子機制的研究及防治靶點的篩選提供基礎(chǔ)。
　　第二部分
　　研究目的:IL-17A作為新近發(fā)現(xiàn)的前炎癥因子，在炎癥或增殖性疾病中發(fā)揮

10、重要作用。本部分研究旨在對IL-17A在放射性肺損傷不同階段（肺炎及肺纖維化）的表達情況及可能發(fā)揮的作用進行探討。
　　研究方法:將61只C57BL/6小鼠隨機分為兩組:(1)假照射組，簡稱Sham組(n=25);(2)照射組，簡稱RT組（n=36）;各組小鼠分別在觀察時間點1周、4周、8周、16周處死，并進行性病理組織學(xué)及分子生物學(xué)檢測。實驗通過Realtime-PCR方法，檢測各組肺組織IL-17AmRNA的表達情況，用2-△

11、△Ct法進行相對定量分析。并通過Westernbolt印記和免疫組化的方法，檢測轉(zhuǎn)錄后各組肺組織中IL-17A蛋白表達的情況。
　　研究結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示:小鼠全肺經(jīng)15Gy射線照射后，肺組織IL-17A在不同階段，呈現(xiàn)出不同程度的高表達。IL-17A陽性顆粒顯示在肺泡巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞等細(xì)胞胞漿內(nèi)。real-timePCR結(jié)果顯示:照射后小鼠肺組織IL-17AmRNA均有不同程度的表達增強，4周時表

12、達最為顯著（觀察時間內(nèi)），8周開始下降，16周繼續(xù)下降，但仍高于基線水平。結(jié)合組織學(xué)切片染色結(jié)果，8周內(nèi)放射性肺泡炎程度隨時間的延長逐漸加重，而IL-17表達量卻在8周時開始下降，提示IL-17A可能在早期放射性肺損傷中作用更為重要。Westernblot半定量檢測顯示IL-17A蛋白表達量在肺照射1周后便開始抬高，4周最高，此后表達量開始下降。IL-17A蛋白表達情況，與mRNA結(jié)果基本一致。
　　研究結(jié)論:小鼠全胸照射后，肺組

13、織IL-17AmRNA及蛋白表達均出現(xiàn)不同程度的升高，與肺泡炎和纖維化形成的時間基本一致，考慮IL-17A在放射性肺泡炎及肺纖維化過程中發(fā)揮一定作用。
　　第三部分
　　研究目的:阻斷IL-17A信號途徑可明顯改善多種炎癥性疾病的轉(zhuǎn)歸。本部分研究旨在探討IL-17A中和抗體對放射性肺損傷小鼠的保護作用。
　　研究方法:我們采用直線加速器一次性15Gy劑量照射C57BL/6小鼠全胸，構(gòu)建小鼠肺損傷模型。將135只小鼠隨機

14、分為四組:①假照射組(Sham，n=30);②照射對照組（RCgroup，n=35）;③治療組（Treatmentgroup，n=35）;④安慰劑組(placebogroup，n=35)。后二組分別于照射后每月第1，3，7，14天，分別靜脈給予IL-17A中和抗體或同型對照IgG抗體4μg/鼠。通過H&E和Masson染色來評估小鼠肺組織炎癥改變及膠原沉積情況。按照Aschcroft評分標(biāo)準(zhǔn)對肺泡炎、肺纖維化程度進行定量分析。支氣管肺泡

15、灌洗液中IL-17A,TGF-β1和IL-6含量采用ELISA的方法測定。羥脯氨酸含量采用堿水解法測定。另外，我們采用Kaplan-Meier方法進行小鼠的生存期分析。
　　研究結(jié)果:照射后16周，照射對照組（RC組）和安慰劑組（Placebo組）小鼠肺組織表現(xiàn)為明顯的炎性細(xì)胞浸潤和間質(zhì)膠原沉積現(xiàn)象，而治療組（Treatment組）小鼠這些病理學(xué)改變則相對較輕。Treatment組小鼠Ⅱ～Ⅲ度肺泡炎發(fā)生率(16％)明顯低于RC組(

16、72％)或Placebo組(64％)。纖維化程度方面，各組Aschcroft評分分別為Treatment組2.8、RC組5.2、Placebo組4.8。Treatment組小鼠的Aschcroft評分明顯低于RC組(P＜0.001)或Placebo組(P＜0.001)。Treatment組小鼠支氣管灌洗液中IL-17A，TGF-β和IL-6含量明顯低于RC組及Placebo組(P＜0.01)。小鼠180天死亡率方面，Treatment組