Tankyrase2在放射性肺損傷中AEC和LFB凋亡調(diào)控中的作用研究.pdf

1、放射性肺損傷(radiation pulmonary injury，RPI)是胸部的腫瘤放射治療、骨髓移植預(yù)處理等常見的并發(fā)癥之一，也見于戰(zhàn)時(shí)的核輻射及平時(shí)的核事故。RPI通常包括早期的放射性間質(zhì)性肺炎（radiation interstitial pneumonitis，RIP）和晚期的放射性肺纖維化（radiation pulmonary fibrosis，RPF）兩個(gè)階段。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道常規(guī)放療RPI的發(fā)病率約為30%，近年隨著放療

2、方案的不斷改進(jìn)優(yōu)化，RPI的發(fā)生率有所降低，但RPI一旦發(fā)生，將嚴(yán)重影響放療后患者的生存質(zhì)量，甚至危及其生命。RPI的發(fā)生也是核輻射和核事故救治的瓶頸問題之一。RPI機(jī)制研究有一定的進(jìn)展，但仍遠(yuǎn)未闡明，也尚缺乏安全有效的防治藥物，故對 RPI機(jī)制進(jìn)行深入研究，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)防治新靶點(diǎn)，對于提高臨床胸部腫瘤放療效果、改善放療患者的生存質(zhì)量以及提高放射損傷救治水平具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　RPI的發(fā)生具有多源性，且具有明顯的種屬和個(gè)體

3、差異，DNA是γ射線損傷靶分子，細(xì)胞凋亡是DNA損傷結(jié)局之一，其在RPI過程中的起到重要作用。肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cell，AEC）是RPI的主要的靶細(xì)胞，肺成纖維細(xì)胞（lung fibroblasts，LFB）是 RPI發(fā)生發(fā)展的主要效應(yīng)細(xì)胞。既往研究發(fā)現(xiàn)Tankyrase2在易/抗RPF小鼠RPI進(jìn)程中存在表達(dá)差異，該分子作為端粒結(jié)合蛋白，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及在細(xì)胞中分布的多樣性使其在多種領(lǐng)域發(fā)揮相應(yīng)的作

4、用，通過調(diào)節(jié)端粒長度可以影響染色體的穩(wěn)定性，而且其與細(xì)胞衰老、死亡和癌變密切相關(guān)；其結(jié)構(gòu)域PARP是細(xì)胞凋亡和壞死的轉(zhuǎn)換點(diǎn)。Tankyrase2在RPI過程中的作用未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過整體和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，探討 Tankyrase2在RPI過程中AEC和LFB凋亡調(diào)控中的作用。
　　材料和方法
　　1.Tankyrase2及細(xì)胞凋亡與RPF種屬差異的相關(guān)性研究：C57BL/6J和C3H/HeN小鼠各60只，隨機(jī)將其各分成對

5、照組和照射組，采用60Coγ射線照射，全胸單次20Gy照射建立RPI模型。分別在照射后15min、1d、3d、7d、1m、3m取材，采用原位末端標(biāo)記法、免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法檢測肺組織的細(xì)胞凋亡、DNA損傷、AIF、TNKS2、PARP表達(dá)，研究細(xì)胞DNA損傷和凋亡在RPI進(jìn)展中的作用及其是否與RPF易發(fā)相關(guān)，并初步探討Tankyrase2與小鼠RPI易發(fā)相關(guān)性。
　　2.Tankyrase2在照射致AEC和LFB生物

6、學(xué)行為改變中的作用研究：A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞傳代培養(yǎng)，60Coγ射線照射，劑量分別為5、10和20Gy，應(yīng)用PARP抑制劑3-AB（濃度為5mM）。分別在照射后30min、1h、3h、6h、12、24h、48h和72h及3-AB作用后24h應(yīng)用上述照射方法處理細(xì)胞，應(yīng)用MTT法、γH2AX免疫熒光、AO/EB染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡等方法檢測細(xì)胞增殖活力、DNA損傷、細(xì)胞凋亡、AIF、TNKS2、PARP的表達(dá)。旨在闡

7、明Tankrase2在照射所致AEC和LFB生物學(xué)行為改變中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.γ射線照射后 C3H/HeN小鼠和 C57BL/6J小鼠肺組織中細(xì)胞凋亡和Tankyrase2表達(dá)存在差異
　　1.1 C3H/HeN小鼠和C57BL/6J小鼠照射后對肺組織中細(xì)胞凋亡存在差異：照射后1-3dC57BL/6J小鼠肺組織凋亡細(xì)胞顯著多于 C3H/HeN小鼠，以肺泡上皮細(xì)胞為主；照射后1m即炎癥期，兩種小鼠細(xì)胞凋亡水

8、平無明顯差異，以上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞為主；照射后3m即纖維化初期C57BL/6J小鼠肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)顯著少于C3H/HeN小鼠，后者以巨噬細(xì)胞的凋亡為主。
　　1.2 C3H/HeN小鼠和C57BL/6J小鼠照射后肺組織中DNA損傷存在差異：照射后1-7d，C57BL/6J小鼠肺組織γH2AX表達(dá)顯著高于C3H/HeN小鼠高；照射后1m，兩種小鼠肺組織γH2AX的表達(dá)無差異；照射后3m，C3H/HeN小鼠肺組織中γH2AX的表達(dá)

9、較C57BL/6J小鼠高。
　　1.3 C3H/HeN小鼠和C57BL/6J小鼠照射后肺組織中AIF表達(dá)存在差異：照射后7d、1m、3m，C3H/HeN小鼠肺組織中AIF的表達(dá)較對照組顯著增加，照射后1d、3d，AIF的表達(dá)較對照組無顯著差異；照射后各時(shí)間點(diǎn)，C57BL/6J小鼠肺組織中AIF的表達(dá)較照射前顯著增加；照射后1d、3d、1m，C3H/HeN小鼠肺組織中AIF的表達(dá)較C57BL/6J小鼠低，照射后7d，C3H/HeN小

10、鼠肺組織中AIF的表達(dá)較C57BL/6J小鼠無顯著差異，照射后3m，C3H/HeN小鼠肺組織中AIF的表達(dá)較C57BL/6J小鼠高。
　　1.4 C3H/HeN小鼠和C57BL/6J小鼠照射后肺組織中TNKS2表達(dá)存在差異：（1） RNA水平，照射前，C3H/HeN小鼠肺組織中TNKS2表達(dá)顯著高于C57BL/6J小鼠，照射后，C3H/HeN小鼠肺組織中TNKS2的表達(dá)高于C57BL/6J小鼠（除3d）。（2）蛋白水平，照射前，C

11、3H/HeN小鼠肺組織中Tankyrase2較C57BL/6J小鼠高，照射后 C3H/HeN小鼠TNKS2表達(dá)較C57BL/6J小鼠高（除1m）。
　　1.5 C3H/HeN小鼠和C57BL/6J小鼠照射后肺組織中PARP表達(dá)存在差異：對照組 C3H/HeN小鼠肺組織 PARP表達(dá)較 C57BL/6J小鼠低；照射后各個(gè)時(shí)間C57BL/6J小鼠肺組織中PARP表達(dá)均較C3H/HeN小鼠高（除1d）。
　　2．γ射線照射后AEC

12、和 LFB DNA損傷和凋亡的發(fā)生及Tankyrase2、PARP表達(dá)等存在差異
　　2.1不同劑量γ射線照射后A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞增殖活力的影響不同：5、10和20Gyγ射線照射后，三個(gè)劑量均抑制A549細(xì)胞增殖；照射后48和72h，10和20Gyγ射線抑制MRC-5細(xì)胞增殖，照射后72h，5Gyγ射線照射促進(jìn)其增殖。
　　2.2不同劑量γ射線照射后A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞DNA損傷的影響不同：不同劑量γ射線照

13、射后A549細(xì)胞均出現(xiàn)DNA損傷，照射后30min、1h、3h，DNA損傷細(xì)胞不斷增加，劑量越高，DNA損傷細(xì)胞越多，照射后6h、12h陽性細(xì)胞逐漸減少，但仍較對照組多；不同劑量γ射線照射后MRC-5細(xì)胞只在部分時(shí)間點(diǎn)可見陽性細(xì)胞出現(xiàn)，及γH2AX的表達(dá)。
　　2.3不同劑量γ射線照射后 A549細(xì)胞和 MRC-5細(xì)胞凋亡的影響不同：（1）20Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)A549細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目均較5和10Gyγ射線照射組多（除12h

14、），10Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)目均多于5Gyγ射線照射組（除3h）。（2）5Gyγ射線照射后，各時(shí)間點(diǎn) A549細(xì)胞AIF的表達(dá)均高于對照組，10Gyγ射線照射后，各時(shí)間點(diǎn) AIF的表達(dá)也均高于對照組，且10Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)AIF表達(dá)均高于5Gyγ射線照射組。（3）5Gy、10Gyγ射線照射后，應(yīng)用抑制劑3-AB處理的A549細(xì)胞，其AIF的表達(dá)顯著低于未處理組細(xì)胞。處理組細(xì)胞，10Gyγ射線照射后A549細(xì)胞的AI

15、F表達(dá)較5Gyγ射線處理組高。（4）不同劑量γ射線照射后MRC-5細(xì)胞未檢測到凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)及AIF的表達(dá)。
　　2.4不同劑量γ射線照射后A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞TNKS2、PARP表達(dá)的影響不同：（1）RNA水平，5和10Gyγ射線照射后1-12h，A549細(xì)胞TNKS2表達(dá)較對照組低，照射后30min，A549細(xì)胞TNKS2表達(dá)顯著高于對照組；蛋白水平，5Gyγ射線照射后30min、12h，Tankyrase2表達(dá)較對照

16、組低，照射后1和3h，A549細(xì)胞的Tankyrase2表達(dá)較對照組高；10Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)Tankyrase2表達(dá)較對照組高（除12h），照射后30min、1h、6h、24h，10Gyγ射線照射組的Tankyrase2表達(dá)較5Gy照射組高。（2）RNA水平，5Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)，MRC-5細(xì)胞TNKS2表達(dá)較照射前高，10Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)，MRC-5細(xì)胞TNKS2的表達(dá)較照射前高（除30min），5Gyγ射線照射

17、后30min、1h、12h，MRC-5細(xì)胞TNKS2表達(dá)較10Gyγ射線照射組高，10Gyγ射線照射后3h，TNKS2的表達(dá)較5Gyγ射線照射組高；蛋白水平，5Gyγ射線照射后30min和24h，MRC-5細(xì)胞的Tankyrase2的表達(dá)較照射前低，照射后1-12h，MRC-5細(xì)胞的Tankyrase2的表達(dá)較照射前高，10Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)Tankyrase2的表達(dá)較照射前高，10Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)Tankyrase2的表

18、達(dá)高于5Gyγ射線照射組（除1h、3h）。（3）5Gyγ射線照射后30min、3h、12h，A549細(xì)胞的PARP表達(dá)較對照組低，照射后1和6h，PARP表達(dá)較照射前高；10Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)PARP表達(dá)較照射前高；10Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)PARP表達(dá)較5Gyγ射線照射組高（除1h）；5Gyγ射線照射后30min、3h和12h，MRC-5細(xì)胞的PARP的表達(dá)較照射前高；照射后24h，MRC-5細(xì)胞的PARP的表達(dá)較照射前低；1

19、0Gyγ射線照射后各時(shí)間點(diǎn)PARP的表達(dá)較照射前高；10Gyγ射線照射后6、12和24h，PARP的表達(dá)高于5Gyγ射線照射組。
　　結(jié)論
　　1.γ射線照射后C57BL/6J與C3H/HeN小鼠肺組織不同細(xì)胞凋亡的差異為兩種小鼠是否易發(fā)RPF的機(jī)制之一：γ射線照射后C57BL/6J小鼠易出現(xiàn)DNA損傷、肺泡上皮細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡，而巨噬細(xì)胞等致纖維化細(xì)胞不易凋亡，故C57BL/6J小鼠易發(fā)生RPF；反之，γ射線照射后C3H