DMSO在預(yù)防和治療局部放射性皮膚損傷中的作用機(jī)理的研究.pdf

1、目的和意義：皮膚在放射生物學(xué)上有著特殊的地位。它是人們在任何情況下接受外照射的必經(jīng)途徑，也是最早被認(rèn)識的受放射損傷的組織。皮膚放射性損傷的機(jī)理，主要是上皮的生發(fā)層細(xì)胞和皮下血管的變化。照射部位毛細(xì)血管反射性擴(kuò)張，局部形成充血性反應(yīng)，出現(xiàn)紅斑，并在皮膚潰瘍形成之前，就可發(fā)生血管損傷和微循環(huán)障礙。而引起傷口愈合不良的原因是進(jìn)行性的微血管阻塞，上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞增生不良。 關(guān)于放射性皮膚損傷的分子生物學(xué)機(jī)理目前尚不十分清楚。一般認(rèn)

2、為，核糖核酸、脫氧核糖核酸、蛋白質(zhì)等分子受電離輻射作用能產(chǎn)生一系列損傷，其作用原理是輻射能量的傳遞和吸收，使體內(nèi)分子激發(fā)和電離，產(chǎn)生自由基以及氧效應(yīng)的存在等，導(dǎo)致大分子的斷裂。 二甲基亞砜(DimethylSulfoxide，DMSO)一方面它是作用很強(qiáng)皮膚滲透劑，可以作為外用藥物使用，另一方面，DMSO是自由基清除劑，又有抗炎、抗細(xì)胞凋亡的作用，同時它的細(xì)胞毒性很低，低濃度使用非常安全。DMSO是一種水溶性和脂溶性都很好的物質(zhì)

3、，能分布到膜的脂質(zhì)雙分子層中，保護(hù)和穩(wěn)定細(xì)胞膜、線粒體膜和溶酶體膜的完整性，并且穩(wěn)定膜上的Bcl-2蛋白，減緩傷后Bcl-2的下調(diào)，充分發(fā)揮其抗凋亡的作用。用DMSO來研究預(yù)防放射性皮膚潰瘍不僅有助于闡明放射潰瘍難愈的機(jī)理，而且可為臨床放療中預(yù)防皮膚損傷的發(fā)生及治療放射性潰瘍提供新的思路和方法。 材料和方法：二級Wistar雌性健康大鼠60只(體重220±10g)。動物在照射前常規(guī)喂養(yǎng)三天，觀察無異常者，隨機(jī)分組，放射性皮膚損傷

4、組(簡稱輻射組)25只，使用二甲基亞砜(DMSO)組(簡稱預(yù)防組)25只，設(shè)正常對照10只。照射前用1％戊巴比妥鈉30mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠固定在特制模板上，用60Coγ射線單次局部照射，鉆源由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院鈷源室提供，照射部位包括雙后大腿、臀部、全尾，照射劑量40Gy，照射時間6分48.8秒，照射率590.08倫/分，照距2.5米，用10cm厚鉛磚屏蔽大鼠其它部位。分別在受照后3、7、14、30、50天于受照區(qū)取材；

5、采用常規(guī)病理學(xué)(宏觀、光鏡)、透射電鏡、組織化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)、原位末端標(biāo)記、電子自旋共振自由基檢測(ESR)和圖像分析等方法，觀察受照后不同時間點局部急性放射性潰瘍和預(yù)防使用DMSO傷口愈合過程中TGF-β、PDGF、VEGF的表達(dá)，以及放射性潰瘍發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、c-fos、c-myc、TNF-a、p53、Rb的變化規(guī)律，自由基的變化，以期從微觀及基因水平上探討局部放射損傷創(chuàng)面難愈機(jī)理，并為

6、臨床應(yīng)用DMSO及相關(guān)制劑進(jìn)行放射損傷預(yù)防提供一定的實驗依據(jù)。 結(jié)果：1.輻射組動物于照射后1天內(nèi)2只死亡，其余動物未出現(xiàn)異常反應(yīng)；照后第9天，23只動物中有20只動物出現(xiàn)尾根部紅腫，足底輕度紅腫：照后第14天，22只動物中有19只尾根部及大腿內(nèi)側(cè)出現(xiàn)脫毛，糜爛，滲出，水腫及小灶狀淺表潰瘍，3只未見明顯潰瘍形成；照后第18天，所有動物首先于尾根部及肛周出現(xiàn)小米至大米粒大小的潰瘍，之后潰瘍多逐漸擴(kuò)大、加深、融合，并伴輕中度感染。照

7、后30天達(dá)高峰，照后50天，潰瘍周圍新生上皮部分覆蓋創(chuàng)面，未見到潰瘍完全愈合。預(yù)防組動物于照后第9天，25只動物中有18只動物出現(xiàn)尾根部紅腫，足底輕度紅腫：照后第14天，2只大鼠死亡，23只動物中有17只尾根部及大腿內(nèi)側(cè)出現(xiàn)脫毛，糜爛，滲出，水腫及小灶狀淺表潰瘍，3只未見明顯潰瘍形成，潰瘍面積及程度較輻射組輕；照后第18天，所有動物首先于尾根部及肛周出現(xiàn)小米至大米粒大小的潰瘍，照后第14～28天死亡動物較多共7只，較輻射組少2只，28天

8、后死亡率明顯下降。潰瘍?nèi)杂兄饾u擴(kuò)大趨勢，但與同時期輻射組相比潰瘍面積小，程度輕、及全身狀態(tài)好。受照后50天，潰瘍周圍新生上皮部分覆蓋創(chuàng)面，傷口明顯縮小，存活動物中有1只完全愈合。通過應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對兩組潰瘍面積進(jìn)行測量結(jié)果表明：輻射組潰瘍面積在測量的各個時間點上最大，潰瘍11天開始出現(xiàn)，14～30天發(fā)展到高峰，30天后潰瘍面積開始縮小。預(yù)防組潰瘍在各時間點面積減小，恢復(fù)較快。 2.急性放射性皮膚潰瘍基本病理過程分為兩期：潰瘍前

9、期和潰瘍期1)潰瘍前期：見于照后1～14天：主要表現(xiàn)為細(xì)胞壞死，少量炎癥細(xì)胞浸潤(以中性粒細(xì)胞為主，淋巴細(xì)胞次之)。小血管炎(小血管壁有炎細(xì)胞浸潤)及內(nèi)皮細(xì)胞的脫落，血栓形成。膠原纖維腫脹、融解、斷裂以及排列紊亂。2)潰瘍期：主要表現(xiàn)為潰瘍壞死組織層與健康組織之間不能形成明顯的分界性炎癥，膠原纖維常有變性、融解、斷裂、水腫，可見有成纖維細(xì)胞松散聚集形成的細(xì)胞團(tuán)塊，畸形成纖維細(xì)胞較多。血管出現(xiàn)充血、出血以及內(nèi)皮細(xì)胞脫落、血管炎等。潰瘍周圍

10、表皮細(xì)胞增生明顯，胞體及胞核增大，層次增多，個別鼠出現(xiàn)表皮萎縮或增生與萎縮并存。 預(yù)防組在潰瘍前期主要表現(xiàn)為表皮細(xì)胞、毛囊上皮細(xì)胞的腫脹，壞死細(xì)胞較少，炎癥細(xì)胞浸潤(以中性粒細(xì)胞為主，淋巴細(xì)胞次之)較多。可見真皮內(nèi)膠原纖維腫脹、融解、斷裂以及排列紊亂，程度較輻射組較輕。預(yù)防組在潰瘍期：主要表現(xiàn)為膠原纖維常有變性、融解、斷裂、水腫，膠原纖維數(shù)量較輻射組多，排列較整齊。潰瘍周圍表皮細(xì)胞增生明顯活躍，逐漸覆蓋潰瘍創(chuàng)面。 3.電

11、鏡觀察輻射組照后1～7天表皮層的變化主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞、基底層細(xì)胞，水腫，體積增大，核仁固縮，染色質(zhì)邊集，核膜出現(xiàn)裂隙，線粒體損傷較重，出現(xiàn)空泡、嵴減少或消失。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并裂解為大泡狀。嚴(yán)重的出現(xiàn)細(xì)胞膜破裂、壞死。照后14～50天，皮膚基底層細(xì)胞，上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞水腫好轉(zhuǎn)，核仁松散，或呈絮狀、染色質(zhì)邊集，核膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞內(nèi)線粒體增多，線粒體損傷減輕，嵴結(jié)構(gòu)清晰。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多?？梢姷蛲黾?xì)胞，表現(xiàn)為

12、細(xì)胞表面的微絨毛及細(xì)胞表面的皺褶消失，染色質(zhì)邊集或出現(xiàn)核碎片，細(xì)胞質(zhì)明顯濃縮，線粒體空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大。 輻射組照后1～7天表皮層的變化主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞、基底層細(xì)胞，腫脹，體積增大，核仁固縮，染色質(zhì)邊集，核膜出現(xiàn)裂隙，線粒體損傷較輻射組輕，出現(xiàn)空泡、嵴減少或消失。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并裂解為小泡狀。嚴(yán)重的出現(xiàn)細(xì)胞膜破裂、壞死。壞死細(xì)胞較輻射組減少。照后14～50天，皮膚基底層細(xì)胞，上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞水腫好轉(zhuǎn)，細(xì)

13、胞核輪廓較平滑整齊，核仁增大，核膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞內(nèi)線粒體增多，線粒體損傷減輕，嵴結(jié)構(gòu)清晰。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多。凋亡細(xì)胞亦可見。 4.ESR檢測結(jié)果：輻射組在照后1～3天皮膚內(nèi)的自由基含量明顯增高，照后3～14天緩慢下降，30～50天下降幅度加大。預(yù)防組在輻射組在照后1～3天皮膚內(nèi)的自由基含量明顯增高，升高的幅度小于輻射組(p＜0.05)照后3～14天緩慢下降，30～50天下降幅度家加大。各時間點自由基含量均小于輻射組。5

14、.TUNEL方法檢測照射后創(chuàng)面凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)量的變化，結(jié)果表明，輻射后照后3～7天即可見凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，主要為組織深層成纖維細(xì)胞，照后14天潰瘍深層可見大量凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，以血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞為主，30天時潰瘍內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰，50天仍可見一定數(shù)量的凋亡細(xì)胞。預(yù)防組在各個時間點上凋亡細(xì)胞均減少(p＜0.01)。 6.輻射組照后3～7天成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞TGFβ、PDG、VEGF等表達(dá)增加，14天達(dá)高峰，30天

15、后出現(xiàn)下降趨勢。預(yù)防組與輻射組相比TGFβ、PDG、VEGF等表達(dá)增加，峰值較高。 7.凋亡相關(guān)基因檢測結(jié)果表明，輻射組潰瘍組織中P53、Bax、c-fos、c-myc及TNFα等基因表達(dá)增加，而bcl-2基因表達(dá)減弱，輻射組P53、Bax、c-fos、c-myc及TNFα等基因表達(dá)減弱，而bcl-2基因下調(diào)受抑制。 全文結(jié)論1.單次大劑量照射可引起急性放射性皮膚潰瘍，其主要特點是：炎癥反應(yīng)減弱，壞死細(xì)胞增加明顯；潰瘍?nèi)?/p>

16、芽組織形成不良，成纖維細(xì)胞及新生毛細(xì)血管較少，尤以淺層明顯；新生上皮覆蓋過程明顯延遲。 2.DMSO對輻射誘導(dǎo)的自由基有清除作用，可以減少自由基的產(chǎn)生，降低自由基對皮膚組織的損害作用。 3.輻射組皮膚創(chuàng)面壞死細(xì)胞及凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，潰瘍淺層細(xì)胞數(shù)量顯著減少，致使肉芽組織形成不良，影響創(chuàng)面愈合。DMSO可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，降低細(xì)胞凋亡率，有利于放射性皮膚損傷的恢復(fù)。 4.輻射組潰瘍底部成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)

17、TGF-β、PDGF、VEGF等因子的蛋白表達(dá)減弱，DMSO可以抑制TGF-β、PDGF、VEGF等蛋白的下調(diào)，促進(jìn)生長因子轉(zhuǎn)錄及翻譯。 5.DMSO有膜穩(wěn)定作用，可以保持細(xì)胞膜的完整性，維護(hù)細(xì)胞膜的正常功能，降低輻射對細(xì)胞的損傷，降低輻射危害。 6.輻射組中P53、Bax、c-fos、c-myc及TNFα等基因表達(dá)增加，而bcl-2基因表達(dá)減弱，提示照射可誘導(dǎo)受照射細(xì)胞凋亡。DMSO對P53、Bax、c-fos、c-m

18、yc及TNFα等基因表達(dá)有抑制作用，同時降低bcl-2基因下調(diào)，從而可以抑制細(xì)胞凋亡，使放射性潰瘍組織細(xì)胞生長因子反應(yīng)性增加，促進(jìn)潰瘍組織的愈合。 綜上所述，皮膚局部經(jīng)大劑量照射后，其潰瘍特點主要為炎癥反應(yīng)顯著減弱，修復(fù)細(xì)胞凋亡和壞死顯著增加，肉芽組織數(shù)量顯著減少，生機(jī)顯著低下，新生上皮覆蓋過程明顯延遲；DMSO通過清除氧自由基，抑制細(xì)胞凋亡降低輻射對皮膚的損傷作用。同時抑制生長因子的下調(diào)，促進(jìn)肉芽組織增生，達(dá)到加快皮膚損傷的作