三羥異黃酮對放射性造血損傷的防護作用及其機理研究.pdf

1、造血組織對電離輻射極為敏感，0.5Gy全身照射后就會引起血液學改變。當全身或大部分機體受到較大劑量射線照射后，造血組織的損傷是機體最早出現的基本損傷之一。放射性造血損傷主要表現為造血功能障礙，由此誘發(fā)機體感染、出血、免疫功能抑制、死亡等。因此，全身照射后造血系統(tǒng)損傷的輕重和恢復的快慢在很大程度上影響放射病的病情和轉歸。 國內外學者經過多年的研究已經篩選出一些輻射防護劑，其中雌激素(estrogens，Es)是研究較多的一類。除雌

2、二醇等天然Es外，人工合成的Es如己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)、已烷雌酚等對實驗性急性放射病有良好的防治效果，不僅可提高實驗動物的存活率、延長其平均生存時間和促進造血系統(tǒng)重建，而且對臨床上因腫瘤放化療所致的白細胞減少癥也有一定的療效。盡管Es對放射性造血損傷有明顯防護作用，但其對造血系統(tǒng)外組織(主要是生殖系統(tǒng))的雌活性(estrogenicaction)可導致嚴重的毒副作用如乳腺癌等，大大限制了其實際臨床應用

3、。近年來一些學者正致力于通過化學合成手段來改造Es分子結構以降低其副作用而僅保留防護放射性造血損傷的效應。 三羥異黃酮(genistein,GEN)是大豆異黃酮的主要成分之一，其結構與雌二醇非常相似，但雌活性僅為雌二醇的10-2～10-3倍，是一種重要的天然植物雌激素(phytoestrogen)，對人體無毒副作用。研究發(fā)現，GEN具有模擬和拮抗雌激素作用、抑制酪氨酸蛋白激酶(TPK)和DNA拓撲異構酶Ⅰ/Ⅱ活性、提高機體免疫力

4、等作用，對乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤以及骨質疏松癥、心血管疾病等均有防治作用。近年來有報道，GEN可使小鼠T淋巴細胞產生的IL-2和IL-3顯著升高，對絕經后的恒河猴乳腺和子宮內膜增生無誘導作用，防止卵巢切除小鼠骨質丟失和骨髓前B淋巴細胞增多且對該小鼠子宮萎縮無逆轉作用。提示，GEN對骨骼和造血系統(tǒng)有選擇性的雌激素效應，而對生殖系統(tǒng)無雌活性。另外，GEN是良好的自由基清除劑，能提高輻射動物的存活率和減輕紫外線導致的皮膚損傷，但對放射性造

5、血損傷是否具有防護作用的研究國外尚無報道。 基于以上分析，結合國內外研究進展，本課題以雄性成年健康昆明小鼠為研究對象，輻射前24h，GEN以160mg/kgb.w.劑量給小鼠灌胃，采用6.0Gy60Coγ射線一次性全身照射復制放射性造血損傷模型，觀察GEN對小鼠存活率及對相關造血指標的影響，并與DES的輻射防護作用進行比較。同時分析照后小鼠骨髓有核細胞(bonemarrownucleatedcells,BMNCs)細胞周期、bc

6、l-2、cyclins、CDKs基因表達及其激酶活性變化、部分造血相關因子受體的表達、血清造血活性、骨髓基質細胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)粘附能力及與細胞粘附有關因子表達等變化，從造血實質細胞和造血微環(huán)境兩個方面，探討GEN對放射性造血損傷防護作用的分子機制。 本研究主要實驗結果如下：1.GEN對正常小鼠的生存無影響。與輻射對照組比較，輻射前24h給予GEN，小鼠照射后死亡率顯著降低，30d存活

7、率提高36.66％，平均生存天數延長3.53d，保護系數為1.60。提示，GEN具有較強的輻射防護作用，該作用強于DES(DES處理組小鼠照后存活率為45.56％)。 2.GEN可導致正常小鼠外周血WBC、淋巴細胞以及BMNCs數量一過性改變。與輻射對照組比較，輻射前24h給予GEN，照射后小鼠骨髓組織、脾臟損傷程度輕，BMNCs及外周血WBC、Hb、血小板、淋巴細胞等下降幅度小且恢復快，CFU-S、CFU-GM形成明顯增多，以

8、上作用均與DES相似，其中GEN在防護BMNCs、WBC、淋巴細胞方面強于DES。提示，GEN可降低骨髓造血干/祖細胞的輻射敏感性，并促進照后殘留的造血干/祖細胞增殖分化，加速輻射受損的造血系統(tǒng)重建，對放射性造血損傷有明顯防護作用。 3.GEN可使正常小鼠BMNCs細胞周期分布一過性改變：給藥后1d，BMNCs增殖抑制、大量細胞阻滯于G0/G1期，G0/G1期細胞數由給藥前的60.47％增加至67.25％；給藥后2d，G0/G1

9、期細胞減少而S期細胞明顯增多，由給藥前的28.70％增加至34.55％；給藥后4d左右，BMNCs細胞周期分布逐漸恢復至正常。該作用可降低BMNCs的輻射敏感性，減少射線對骨髓造血細胞的直接殺傷和增殖抑制作用，有利于照后骨髓造血系統(tǒng)的重建。同時，這可能也是GEN導致正常小鼠外周血像一過性改變的機制之一。 4.輻射前24h給予GEN，照后阻滯于G0/G1期的小鼠BMNCs數量明顯減少，同時BMNCsbcl-2、CyclinD1、C

10、yclinE、CDK2、CDK4蛋白和mRNA表達以及CyclinE-CDK2活性等均有不同程度的提高。推測，減少照后骨髓造血細胞的G0/G1期阻滯、抑制造血細胞凋亡、改變造血細胞細胞周期和提高殘留造血細胞的增殖分化能力可能是GEN防護放射性造血損傷的主要分子機制之一。 5.與輻射對照組比較，輻射前24h給予GEN，射線對小鼠BMSCs的損傷程度減小，同時BMSCsCFU-F形成及貼壁能力均有不同程度的提高。流式細胞分析發(fā)現，G

11、EN能誘導輻射受損的BMSCs上細胞粘附分子VCAM-1及細胞外基質FN、LN等的表達增加，促進BMSCs與造血細胞以及造血細胞間的粘附，進一步誘導造血細胞和BMSCs細胞周期改變，促進細胞增殖和分化，加速放射性造血損傷的修復和重建。提示，預防性給予GEN對小鼠BMSCs的形態(tài)和功能均有明顯的保護作用。 6.與輻射對照組比較，輻射前24h給予GEN，輻射后該組小鼠血清造血刺激活性顯著增強，使正常小鼠骨髓細胞CFU-GM、CFU-

12、E形成明顯增多，而且對粒/巨系祖細胞的刺激活性較紅系強。同時，GEN預處理組小鼠照后血清造血抑制活性明顯降低，但對紅系和粒系祖細胞的抑制活性差異不明顯。另外，輻射前24h給藥，GEN可減少射線導致的骨髓造血細胞c-kit和IL-3Ra表達的抑制，輻射后9d表達陽性的骨髓造血細胞數量明顯較輻射對照組增多。提示，預防性的給予GEN可導致照后小鼠血清造血因子水平改變并誘導骨髓造血細胞上c-kit和IL-3R的表達，促進損傷后造血系統(tǒng)重建。