長鏈非編碼RNA LINC00261在Barrett食管、食管腺癌組織中的表達(dá)及其作用機制研究.pdf

1、探討長鏈非編碼RNA LINC00261在Barrett食管、食管腺癌組織中的表達(dá)及其作用機制。分別通過以下方法進(jìn)行探討:取20例正常食管鱗狀上皮組織，20例Barrett食管組織及20例食管腺癌組織分別進(jìn)行石蠟包埋，利用RecoverAlTM Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE Tissues試劑盒提取總RNA，利用qRT-PCR技術(shù)檢測LINC00261在組織中的表達(dá)變化;將正常食管鱗

2、狀上皮細(xì)胞系(Het-1A)、Barrett食管細(xì)胞系(BE CP-A)及Barrett食管相關(guān)腺癌細(xì)胞系（0E33和skgt4）接種于含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞并利用Takara公司的總mRNA試劑盒提取細(xì)胞總RNA，利用qRT-PCR技術(shù)檢測LINC00261在細(xì)胞中的表達(dá)變化;將人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)于人胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層，取對數(shù)生長期細(xì)胞分別給予不同濃度的酸暴露及膽酸(總濃

3、度0，100，300，1000μM)處理，并于處理24，48，72h后提取細(xì)胞總RNA;采用qRT-PCR法檢測LINC00261的表達(dá)變化;采用生物信息學(xué)的方法分析LINC00261可能調(diào)控的下游靶基因;構(gòu)建LINC00261慢病毒載體并轉(zhuǎn)染人胚胎干細(xì)胞，qRT-PCR技術(shù)驗證LINC00261在細(xì)胞中的表達(dá)變化，采用Western blot技術(shù)檢測LINC00261慢病毒轉(zhuǎn)染后FOXA2蛋白表達(dá)水平的變化;采用FOXA2慢病毒表達(dá)載

4、體轉(zhuǎn)染人胚胎干細(xì)胞，觀察高表達(dá)FOXA2對酸暴露及膽酸處理后人胚胎干細(xì)胞中CDX2及MUC2蛋白表達(dá)的影響;采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有顯著性。
　　通過上述研究發(fā)現(xiàn)，與正常食管鱗狀上皮組織相比，LINC00261在Barrett食管及食管腺癌組織標(biāo)本中表達(dá)均顯著上調(diào);與正常食管鱗狀上皮細(xì)胞系相比，LINC00261在Barrett食管細(xì)胞系及Barrett食管相關(guān)腺癌細(xì)胞系中表達(dá)水平

5、也顯著增高;與正常對照組相比，酸暴露及膽酸誘導(dǎo)可導(dǎo)致LINC00261表達(dá)顯著上調(diào)，并表現(xiàn)出一定的濃度依賴性及時間依賴性;生物信息學(xué)分析表明LINC00261恰好位于叉頭框蛋白A2(forkhead box protein A2，F(xiàn)OXA2)上游啟動子區(qū)域，提示LINC00261可能參與FOXA2表達(dá)的負(fù)性調(diào)控;進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)高表達(dá)LINC00261可顯著抑制FOXA2蛋白的表達(dá)水平;酸暴露及膽酸可誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞FOXA2表達(dá)下調(diào)，C