長鏈非編碼RNAMEG3在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：食管癌是來源于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，是臨床常見的消化道腫瘤之一，在全世界的惡性腫瘤發(fā)病率中，食管癌居于第8位。在2012年約有45.6萬食管癌新發(fā)病例，占全球惡性腫瘤病例的3％，食管癌居世界癌癥死因第6位，2012年死亡病例約40萬，占全球癌癥死亡人數(shù)的5%。我國是食管癌最高發(fā)的國家之一，每年有超過22萬例的食管癌新發(fā)病例，死亡約20萬例目前，超過90%的食管癌患者確診時(shí)已經(jīng)進(jìn)展到中晚期，生活質(zhì)量低下，總體的5年生存率不到20%

2、。隨著現(xiàn)在科技的進(jìn)步以及大量科研工作者的深入研究，對(duì)食管癌的認(rèn)識(shí)雖然有了更深的了解，但提高我國食管癌診治水平仍是艱巨而緊迫的研究難題。因此研究食管癌的發(fā)病機(jī)制，尋找食管癌的分子生物學(xué)早期診斷指標(biāo)，探討食管癌的靶向治療，不僅在臨床癌癥診治方面具有重要的價(jià)值，而且對(duì)于整個(gè)社會(huì)更有深遠(yuǎn)的積極意義。
　　目前的一些研究發(fā)現(xiàn)，食管癌的發(fā)生發(fā)展與許多遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)的異常改變有關(guān)，但迄今為止，食管癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍未被完全闡明，缺少有

3、效的分子靶點(diǎn)及分子標(biāo)志物來預(yù)測(cè)療效。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，廣泛存在于人類基因組中，可通過不同方式影響編碼基因的表達(dá)量和功能，對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程起調(diào)控作用。母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene3，MEG3)是目前發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA中的一個(gè)，其主要表達(dá)于正常大腦、骨髓、乳腺、子宮、肺及胃腸道等組織中，而在多種惡性腫瘤

4、組織中表達(dá)卻明顯減低乃至缺失。有研究表明胃癌細(xì)胞中的MEG3表達(dá)水平顯著下調(diào)，而過表達(dá)MEG3可明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖。但MEG3在食管癌中有何作用尚不明確。本研究旨在闡明lncRNA MEG3在食管癌中的表達(dá)情況，探索MEG3表達(dá)水平的變化對(duì)體外食管癌細(xì)胞的影響，進(jìn)一步為食管癌預(yù)后提供新的標(biāo)志物，為食管癌的干預(yù)治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1、食管癌組織及食管癌細(xì)胞系中的lncRNA MEG3表達(dá)研究
　　1.

5、1 收集32例手術(shù)治療的食管癌患者的腫瘤組織及腫瘤旁正常食管組織，所有患者術(shù)前均未接受放化療，術(shù)后病理確診為食管癌，將切除的新鮮癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織用PBS液清洗干凈并放入液氮中速凍24小時(shí)，然后迅速移至-80℃冰箱保存。
　　1.2 qRT-PCR檢測(cè)腫瘤組織及瘤旁正常組織中MEG3表達(dá)：首先采用Trizol法提取腫瘤組織及正常組織的總RNA；然后利用凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定，確保RNA的完整性；設(shè)計(jì)lncRNA MEG3

6、的反轉(zhuǎn)錄的上、下游引物，參照GeneBank所刊登的序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件primerprimer5對(duì)MEG3基因和GAPDH基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，以GAPDH作為對(duì)照；后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR來檢測(cè)細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)MEG3的表達(dá)情況。
　　1.3 購買食管癌細(xì)胞系Eca-109以及人正常食管上皮細(xì)胞系HEEC。
　　1.4 細(xì)胞培養(yǎng)：CO25%、37℃的孵箱。每1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％～90％時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)

7、。
　　1.5 qRT-PCR檢測(cè)食管癌細(xì)胞系Eca-109以及人正常食管上皮細(xì)胞系HEEC中MEG3表達(dá)：應(yīng)用Trizol方法提取總RNA；利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行對(duì)提取的 RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定；最后應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)lncRNA MEG3的表達(dá)情況。
　　1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P≤0．0

8、5則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、lncRNA MEG3對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。
　　2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、引物合成及目的基因的合成方法同第一部分實(shí)驗(yàn)。
　　2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
　　首先根據(jù)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，鑒定成功后構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-lncRNA MEG3，構(gòu)建完成后使用雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳再次進(jìn)行確定目的基因的真實(shí)性。使用空的pcDNA

9、載體作為陰性對(duì)照組。
　　2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
　　所有用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體（pcDNA-MEG3和空載體）經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒Midiprep提取重組質(zhì)粒。按照使用說明書通過FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA-MEG3或空載體轉(zhuǎn)染至6孔平板上培養(yǎng)的細(xì)胞。48小時(shí)后檢測(cè)結(jié)果。
　　2.4 G418篩選細(xì)胞系
　　首先確定抗生素G418篩選濃度，然后篩選出較穩(wěn)定并且過表達(dá)lncRNA MEG3的細(xì)胞系Eca109-pCDNA

10、3.1-lncRNA MEG3，并使用real-timePCR技術(shù)來檢測(cè)目的基因表達(dá)水平，以確定細(xì)胞系是否已經(jīng)建立成功，以轉(zhuǎn)染空載體的陰性對(duì)照組及僅加入轉(zhuǎn)染試劑的空白對(duì)照組作為對(duì)比。
　　2.5 細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)
　　使用MTT試劑盒并按其說明書對(duì)過表達(dá)的食管癌細(xì)胞系經(jīng)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，來檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，以轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組作為對(duì)比。
　　2.6 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)
　　利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)對(duì)過表達(dá)的食

11、管癌細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)，以轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組作為對(duì)比。
　　2.7 細(xì)胞劃痕運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)
　　對(duì)于過表達(dá)的食管癌細(xì)胞系通過劃痕實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，以轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組作為對(duì)比。
　　2.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)
　　將轉(zhuǎn)染后的食管癌細(xì)胞裂解，獲取細(xì)胞總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞蛋白含量，取50μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合，然后依次孵育I抗及II抗最后用

12、ECL顯色液顯影檢測(cè)細(xì)胞中p53的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果通過ImageJ進(jìn)行灰度值分析。
　　2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P≤0．05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、食管癌組織及食管癌細(xì)胞系中的lncRNA MEG3表達(dá)研究
　　1.1 lncRNA ME

13、G3在食管癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織。
　　1.2 lncRNA MEG3在食管癌細(xì)胞系Eca109中的表達(dá)明顯低于人食管正常細(xì)胞系HEEC。
　　2、 lncRNA MEG3對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。
　　2.1 細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)：上調(diào)MEG3的表達(dá)水平能降低食管癌細(xì)胞系Eca109的增殖能力。
　　2.2 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：過表達(dá)MEG3的食管癌細(xì)胞系Eca109的細(xì)胞穿膜數(shù)與對(duì)照

14、組比較明顯減少。
　　2.3 細(xì)胞劃痕運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)顯示：過表達(dá)MEG3后的細(xì)胞間距較對(duì)照組明顯增大。
　　2.4 Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示：過表達(dá)MEG3的食管癌細(xì)胞系Eca109中的p53蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著增加。
　　結(jié)論：
　　1、lncRNA MEG3在食管癌組織及細(xì)胞系中明顯下調(diào)，提示其與腫瘤的發(fā)生有很大的關(guān)系，并且可能發(fā)揮抑癌基因的作用。
　　2、在食管癌細(xì)胞中過表達(dá)MEG3可抑制腫瘤細(xì)胞