膽汁酸在Barrett食管發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、目的:
　　Barrett食管(Barrett's esophagus，BE)是一種癌前病變，是指正常食管鱗狀上皮被包含杯狀細(xì)胞的柱狀上皮所取代的一種病理現(xiàn)象。BE發(fā)生與食管慢性炎癥刺激相關(guān)，BE引起的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是食管腺癌的重要重要致病因素。
　　目前已經(jīng)證實(shí)導(dǎo)致BE發(fā)生的一個(gè)重要因素是慢性胃食管反流癥(GERD)。5-10％的胃食管反流患者在內(nèi)鏡下發(fā)現(xiàn)Barrett食管。研究表明，十二指腸-胃-食管反流在BE的發(fā)病機(jī)制中起

2、著重要作用。食管鱗狀上皮細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間受返流液刺激可能使食管粘膜內(nèi)膽汁酸易感受體異位表達(dá)，促進(jìn)產(chǎn)生BE并進(jìn)一步發(fā)展為食管腺癌，又稱之為Barrett's腺癌(BA)。BE患者發(fā)生食管腺癌的風(fēng)險(xiǎn)要比正常人高。但是BE發(fā)生發(fā)展過程中的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，以往通過體外細(xì)胞培養(yǎng)方式研究化生及腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，但是由于機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性，尚不能很好地反映生物體內(nèi)食管粘膜由鱗狀上皮到BE甚至食管腺癌的過程。
　　以往研究表明引起食管損傷及炎癥

3、最重要的因素是胃反流物中的胃酸及胃蛋白酶。長(zhǎng)期暴露于胃酸及消化酶的環(huán)境中，食管粘膜受到損傷，并發(fā)生柱狀上皮化生，進(jìn)而替代正常的食管鱗狀上皮。最近研究發(fā)現(xiàn)反流液中膽汁酸鹽在食管粘膜損傷及化生中起到重要作用。一些臨床研究檢測(cè)表明BE患者中膽汁酸鹽反流更為常見，BE患者食管內(nèi)膽汁酸鹽濃度明顯高于單純的胃食管反流患者。另外有體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證明膽汁酸鹽在BE的發(fā)生過程中具有促進(jìn)作用。膽汁酸通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮作用，膽汁酸受體(FXR)的變化與腫

4、的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)FXR在BE組織中高表達(dá)，提示膽汁酸及其受體在BE發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　BE化生過程通常伴隨腸道特異性基因的表達(dá)，在食管粘膜腸上皮化生過程中的一個(gè)初始誘導(dǎo)基因是CDX-2。CDX-2是腸道特異性表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，其基因表達(dá)增強(qiáng)往往與胃腸道粘膜上皮化生和異形性增生以及腫瘤的發(fā)生相關(guān)。另外體外細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，CDX-2具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用，而且研究證實(shí)CDX-2與Muc2啟動(dòng)子相互作用并激發(fā)其

5、轉(zhuǎn)錄，從而在杯狀細(xì)胞分化中起到重要作用。在胃食管反流液慢性刺激下食管扁平鱗狀上皮區(qū)域出現(xiàn)CDX-2及Muc2表達(dá)，可以證實(shí)食管粘膜已經(jīng)在致病因素的作用下啟動(dòng)化生過程。膽汁酸鹽的致癌作用與其引起食管粘膜的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)，臨床研究發(fā)現(xiàn)BE上皮細(xì)胞中促炎基因如COX-2、PPAR-g、促炎細(xì)胞因子等表達(dá)上調(diào)，粘膜炎癥程度加重以及BE發(fā)生率與組織中PGE2水平的升高顯著相關(guān)，COX-2是PGs合成中的關(guān)鍵性限速酶，COX-2高表達(dá)后能夠引起食

6、管粘膜組織中前列腺素E2(PGE2)水平升高，粘膜的炎癥程度相應(yīng)加重。另外研究認(rèn)為慢性炎癥可能通過促進(jìn)釋放氧自由基(ROS)引起的氧化應(yīng)激而引起B(yǎng)E的發(fā)生發(fā)展，各種炎性介質(zhì)誘導(dǎo)ROS釋放，因此導(dǎo)致食管粘膜持續(xù)慢性氧化應(yīng)激損傷，并隨著食管炎癥加重，Barrett食管及腺癌的發(fā)生率相應(yīng)升高。
　　另外，在BE化生及腫瘤發(fā)生過程中伴隨著一系列信號(hào)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等表達(dá)，如Bmp4、Tff2、Krt19等。Bmp4作為BE上皮的標(biāo)志性蛋白，

7、膽汁酸可以通過Bmp4信號(hào)通路調(diào)節(jié)CDX-2的表達(dá)并促進(jìn)食管鱗狀上皮腸化生。Tff2對(duì)食管粘膜具有保護(hù)作用，促進(jìn)損傷粘膜的修復(fù)，在炎性病變中上調(diào)表達(dá)，Krt19是上皮細(xì)胞的骨架蛋白，在上皮原發(fā)腫瘤中表達(dá)，并可以作為上皮源性腫瘤的微轉(zhuǎn)移標(biāo)記物。通過對(duì)Bmp4、Tff2、Krt19等基因表達(dá)的檢測(cè)，有助于了解BE及EAC的病理生理的機(jī)制。
　　本研究著重通過人體BE組織標(biāo)本及動(dòng)物模型食管病變標(biāo)本，對(duì)膽汁酸在BE發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行體內(nèi)

8、實(shí)驗(yàn)研究。為進(jìn)一步研究膽汁酸及其受體與BE的發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.材料
　　1.1人體BE組織標(biāo)本
　　來源于山東省千佛山醫(yī)院2010～2014門診及住院患者經(jīng)內(nèi)鏡醫(yī)師及病理科醫(yī)師進(jìn)行病理確診的BE病人20例，取得患者同意，采取患者BE病變標(biāo)本組織及周圍正常食管粘膜作對(duì)照。BE標(biāo)本采取自胃食管交界處開始向上每個(gè)厘米均采取相應(yīng)四個(gè)象限標(biāo)本。
　　1.2 Wister大鼠的分組與處理
　

9、　2月大Wister雄性大鼠（重約250g-280g）購(gòu)于山東大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，分為手術(shù)組和非手術(shù)組。在手術(shù)組分設(shè)三組，A組包含30只大鼠，通過手術(shù)行全胃切除，十二指腸近端封閉，并行食管-十二指腸端側(cè)吻合術(shù)，形成單純膽汁酸反流組。B組包含30只大鼠，行食管胃交界處縱行切開并與十二指腸行側(cè)側(cè)吻合術(shù)，手術(shù)造成胃酸及膽汁酸混合性反流。C組為對(duì)照組，10只大鼠行單純開腹關(guān)腹手術(shù)。
　　非手術(shù)組大鼠也分設(shè)三組，D組包含30只大鼠，用含膽汁酸

10、(0.3％ DCA，pH7.0)的飲用水進(jìn)行飼喂。E組30只大鼠用含胃蛋白酶(0.5mg/L)的酸性飲用水(HCl0.01mol/L，pH2.0)進(jìn)行飼喂。F組為對(duì)照組，10只大鼠用正常飼料及清潔水飼喂。
　　所有大鼠均飼養(yǎng)6個(gè)月，6個(gè)月后存活的大鼠處死后進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　2.方法：
　　2.1人體BE標(biāo)本處理。
　　2.1.1免疫組化法檢測(cè)FXR表達(dá)。Western blot檢測(cè)FXR蛋白表達(dá)。
　　

11、2.1.2應(yīng)用免疫組化染色檢測(cè)CDX-2及Muc2表達(dá)。
　　2.1.3應(yīng)用Real-Time PCR法檢測(cè)人體BE組織及正常食管粘膜組織COX-2 mRNA水平。
　　2.1.4對(duì)FXR與CDX-2、COX-2表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析。
　　2.2模型動(dòng)物食管標(biāo)本處理。
　　2.2.1組織學(xué)檢測(cè)
　　大鼠麻醉后處死，取出食管組織，沿食管長(zhǎng)軸縱行剪開食管，觀察食管大體病變情況，并將食管組織縱行均分成三份，分別進(jìn)行

12、病理學(xué)及生化研究。食管HE染色切片經(jīng)兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師分別進(jìn)行病理診斷，食管病變分為角化過度、上皮增生、食管炎癥、食管潰瘍、Barrett's食管、及食管腺癌。
　　2.2.2免疫組化法檢測(cè)食管FXR表達(dá)，免疫組化染色檢測(cè)食管組織CDX-2及Muc2表達(dá)。
　　2.2.3 ELISA法檢測(cè)動(dòng)物血漿中IL-6及TNF-a水平。
　　2.2.4 Semi-quantitative RT-PCR法檢鋇Cdx2、Muc2、B

13、mp4，Kit19以及 Tff2基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.人體BE組織實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.1 FXR在人體BE組織中表達(dá)明顯升高。本實(shí)驗(yàn)中共包含20例BE患者，免疫組化法染色顯示BE組織中FXR染色陽性，其中以核染色為主，周邊組織亦有染色，正常食管粘膜組織FXR陽性染色少見。West blot檢測(cè)顯示FXR在BE組織中高表達(dá)，在正常食管粘膜組織中無表達(dá)或弱表達(dá)，具有顯著性差異。
　　1.2免疫組化染色顯示，

14、人體BE組織中CDX-2、Muc2表達(dá)弱陽性至強(qiáng)陽性，在正常食管粘膜中幾乎不表達(dá)，分析發(fā)現(xiàn)CDX-2、Muc2在正常食管粘膜組織中的表達(dá)顯著低于BE組織中的表達(dá)。較正常食管粘膜BE組織中CDX-2 mRNA水平明顯升高，具有顯著性差異。
　　1.3 Real-Time PCR檢查顯示BE組織中COX-2 mRNA水平較正常食管粘膜組織明顯升高。
　　1.4對(duì)FXR表達(dá)水平及CDX-2、COX-2表達(dá)水平分別進(jìn)行相關(guān)性分析，顯

15、示FXR表達(dá)與CDX-2成表達(dá)成正相關(guān)，與COX-2表達(dá)成正相關(guān)，CDX-2表達(dá)與COX-2表達(dá)成正相關(guān)。
　　2.動(dòng)物模型試驗(yàn)結(jié)果
　　2.1手術(shù)模型組中，與對(duì)照組相比兩種反流手術(shù)均導(dǎo)致食管炎癥、BE及食管腺癌的發(fā)生，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但兩組反流性手術(shù)之間發(fā)生食管炎癥、BE及食管腺癌的幾率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與單純膽汁反流相比混合反流并未增加BE發(fā)生率(x2=0.0565，p＞0.05)。但是在非手術(shù)模型組中，與對(duì)照組相比喂

16、食膽汁酸組與喂食胃酸及胃蛋白酶組均可導(dǎo)致食管炎癥及BE發(fā)生，而且兩組之間導(dǎo)致BE(x2=4.83，p＜0.05)發(fā)生的幾率具有明顯差異。
　　2.2同人體組織一樣，F(xiàn)XR、CDX-2及Mue2在診斷為BE的大鼠食管組織中高表達(dá)，在對(duì)照組中低表達(dá)或無表達(dá)。
　　2.3在手術(shù)模型組中，單純膽汁酸反流導(dǎo)致食管炎癥發(fā)生率為80％，混合反流發(fā)生率為90.5％，兩者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.04，p＞0.05)。但是在非手術(shù)模型組中膽

17、汁酸飼喂較加入胃蛋白酶的酸性液體飼喂導(dǎo)致食管炎癥的發(fā)生率有明顯不同(x2=8.96，p＜0.01)。在兩種返流手術(shù)組及膽汁酸飼喂組中檢測(cè)到IL-6和TNF-a的水平明顯升高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.4通過Semi-quantitative RT-PCR法測(cè)得兩種反流手術(shù)組及膽汁酸飼喂組中CDX-2和Muc2表達(dá)水平升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并與免疫組化結(jié)果一致。作為細(xì)胞分化增生的標(biāo)記Bmp4，Kit19及Tff2表達(dá)水平在兩種

18、反流手術(shù)組及膽汁酸飼喂組中也升高，結(jié)果具有顯著性差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　FXR在BE中表達(dá)較正常食管粘膜組織明顯升高。BE組織中CDX-2、Muc2和COX-2表達(dá)明顯升高，并與FXR表達(dá)正相關(guān)，通過成功建立起兩種動(dòng)物模型并研究證實(shí)膽汁酸而非胃酸是BE發(fā)生中的主要因素，膽汁酸及其受體導(dǎo)致BE的發(fā)生與其引發(fā)食管的炎性反應(yīng)有關(guān)，引起炎性反應(yīng)介質(zhì)IL-6和TNF-a高表達(dá)，并導(dǎo)致相應(yīng)的分化增生基因高表達(dá)，最終導(dǎo)致B