膽汁酸在Barrett食管發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、目的:
　　Barrett食管(Barrett's esophagus，BE)是一種癌前病變，是指正常食管鱗狀上皮被包含杯狀細胞的柱狀上皮所取代的一種病理現(xiàn)象。BE發(fā)生與食管慢性炎癥刺激相關(guān)，BE引起的細胞轉(zhuǎn)化，是食管腺癌的重要重要致病因素。
　　目前已經(jīng)證實導致BE發(fā)生的一個重要因素是慢性胃食管反流癥(GERD)。5-10％的胃食管反流患者在內(nèi)鏡下發(fā)現(xiàn)Barrett食管。研究表明，十二指腸-胃-食管反流在BE的發(fā)病機制中起

2、著重要作用。食管鱗狀上皮細胞長時間受返流液刺激可能使食管粘膜內(nèi)膽汁酸易感受體異位表達，促進產(chǎn)生BE并進一步發(fā)展為食管腺癌，又稱之為Barrett's腺癌(BA)。BE患者發(fā)生食管腺癌的風險要比正常人高。但是BE發(fā)生發(fā)展過程中的發(fā)病機制尚不清楚，以往通過體外細胞培養(yǎng)方式研究化生及腫瘤發(fā)生的分子機制，但是由于機體內(nèi)免疫系統(tǒng)的復雜性，尚不能很好地反映生物體內(nèi)食管粘膜由鱗狀上皮到BE甚至食管腺癌的過程。
　　以往研究表明引起食管損傷及炎癥

3、最重要的因素是胃反流物中的胃酸及胃蛋白酶。長期暴露于胃酸及消化酶的環(huán)境中，食管粘膜受到損傷，并發(fā)生柱狀上皮化生，進而替代正常的食管鱗狀上皮。最近研究發(fā)現(xiàn)反流液中膽汁酸鹽在食管粘膜損傷及化生中起到重要作用。一些臨床研究檢測表明BE患者中膽汁酸鹽反流更為常見，BE患者食管內(nèi)膽汁酸鹽濃度明顯高于單純的胃食管反流患者。另外有體內(nèi)及體外實驗證明膽汁酸鹽在BE的發(fā)生過程中具有促進作用。膽汁酸通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮作用，膽汁酸受體(FXR)的變化與腫

4、的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)FXR在BE組織中高表達，提示膽汁酸及其受體在BE發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　BE化生過程通常伴隨腸道特異性基因的表達，在食管粘膜腸上皮化生過程中的一個初始誘導基因是CDX-2。CDX-2是腸道特異性表達的核轉(zhuǎn)錄因子，其基因表達增強往往與胃腸道粘膜上皮化生和異形性增生以及腫瘤的發(fā)生相關(guān)。另外體外細胞的研究發(fā)現(xiàn)，CDX-2具有誘導細胞分化的作用，而且研究證實CDX-2與Muc2啟動子相互作用并激發(fā)其

5、轉(zhuǎn)錄，從而在杯狀細胞分化中起到重要作用。在胃食管反流液慢性刺激下食管扁平鱗狀上皮區(qū)域出現(xiàn)CDX-2及Muc2表達，可以證實食管粘膜已經(jīng)在致病因素的作用下啟動化生過程。膽汁酸鹽的致癌作用與其引起食管粘膜的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)，臨床研究發(fā)現(xiàn)BE上皮細胞中促炎基因如COX-2、PPAR-g、促炎細胞因子等表達上調(diào)，粘膜炎癥程度加重以及BE發(fā)生率與組織中PGE2水平的升高顯著相關(guān)，COX-2是PGs合成中的關(guān)鍵性限速酶，COX-2高表達后能夠引起食

6、管粘膜組織中前列腺素E2(PGE2)水平升高，粘膜的炎癥程度相應(yīng)加重。另外研究認為慢性炎癥可能通過促進釋放氧自由基(ROS)引起的氧化應(yīng)激而引起B(yǎng)E的發(fā)生發(fā)展，各種炎性介質(zhì)誘導ROS釋放，因此導致食管粘膜持續(xù)慢性氧化應(yīng)激損傷，并隨著食管炎癥加重，Barrett食管及腺癌的發(fā)生率相應(yīng)升高。
　　另外，在BE化生及腫瘤發(fā)生過程中伴隨著一系列信號蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等表達，如Bmp4、Tff2、Krt19等。Bmp4作為BE上皮的標志性蛋白，

7、膽汁酸可以通過Bmp4信號通路調(diào)節(jié)CDX-2的表達并促進食管鱗狀上皮腸化生。Tff2對食管粘膜具有保護作用，促進損傷粘膜的修復，在炎性病變中上調(diào)表達，Krt19是上皮細胞的骨架蛋白，在上皮原發(fā)腫瘤中表達，并可以作為上皮源性腫瘤的微轉(zhuǎn)移標記物。通過對Bmp4、Tff2、Krt19等基因表達的檢測，有助于了解BE及EAC的病理生理的機制。
　　本研究著重通過人體BE組織標本及動物模型食管病變標本，對膽汁酸在BE發(fā)病機制中的作用進行體內(nèi)

8、實驗研究。為進一步研究膽汁酸及其受體與BE的發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.材料
　　1.1人體BE組織標本
　　來源于山東省千佛山醫(yī)院2010～2014門診及住院患者經(jīng)內(nèi)鏡醫(yī)師及病理科醫(yī)師進行病理確診的BE病人20例，取得患者同意，采取患者BE病變標本組織及周圍正常食管粘膜作對照。BE標本采取自胃食管交界處開始向上每個厘米均采取相應(yīng)四個象限標本。
　　1.2 Wister大鼠的分組與處理
　

9、　2月大Wister雄性大鼠（重約250g-280g）購于山東大學試驗動物中心，分為手術(shù)組和非手術(shù)組。在手術(shù)組分設(shè)三組，A組包含30只大鼠，通過手術(shù)行全胃切除，十二指腸近端封閉，并行食管-十二指腸端側(cè)吻合術(shù)，形成單純膽汁酸反流組。B組包含30只大鼠，行食管胃交界處縱行切開并與十二指腸行側(cè)側(cè)吻合術(shù)，手術(shù)造成胃酸及膽汁酸混合性反流。C組為對照組，10只大鼠行單純開腹關(guān)腹手術(shù)。
　　非手術(shù)組大鼠也分設(shè)三組，D組包含30只大鼠，用含膽汁酸

10、(0.3％ DCA，pH7.0)的飲用水進行飼喂。E組30只大鼠用含胃蛋白酶(0.5mg/L)的酸性飲用水(HCl0.01mol/L，pH2.0)進行飼喂。F組為對照組，10只大鼠用正常飼料及清潔水飼喂。
　　所有大鼠均飼養(yǎng)6個月，6個月后存活的大鼠處死后進行進一步研究。
　　2.方法：
　　2.1人體BE標本處理。
　　2.1.1免疫組化法檢測FXR表達。Western blot檢測FXR蛋白表達。
　　

11、2.1.2應(yīng)用免疫組化染色檢測CDX-2及Muc2表達。
　　2.1.3應(yīng)用Real-Time PCR法檢測人體BE組織及正常食管粘膜組織COX-2 mRNA水平。
　　2.1.4對FXR與CDX-2、COX-2表達相關(guān)性進行分析。
　　2.2模型動物食管標本處理。
　　2.2.1組織學檢測
　　大鼠麻醉后處死，取出食管組織，沿食管長軸縱行剪開食管，觀察食管大體病變情況，并將食管組織縱行均分成三份，分別進行

12、病理學及生化研究。食管HE染色切片經(jīng)兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師分別進行病理診斷，食管病變分為角化過度、上皮增生、食管炎癥、食管潰瘍、Barrett's食管、及食管腺癌。
　　2.2.2免疫組化法檢測食管FXR表達，免疫組化染色檢測食管組織CDX-2及Muc2表達。
　　2.2.3 ELISA法檢測動物血漿中IL-6及TNF-a水平。
　　2.2.4 Semi-quantitative RT-PCR法檢鋇Cdx2、Muc2、B

13、mp4，Kit19以及 Tff2基因的表達。
　　結(jié)果:
　　1.人體BE組織實驗結(jié)果
　　1.1 FXR在人體BE組織中表達明顯升高。本實驗中共包含20例BE患者，免疫組化法染色顯示BE組織中FXR染色陽性，其中以核染色為主，周邊組織亦有染色，正常食管粘膜組織FXR陽性染色少見。West blot檢測顯示FXR在BE組織中高表達，在正常食管粘膜組織中無表達或弱表達，具有顯著性差異。
　　1.2免疫組化染色顯示，

14、人體BE組織中CDX-2、Muc2表達弱陽性至強陽性，在正常食管粘膜中幾乎不表達，分析發(fā)現(xiàn)CDX-2、Muc2在正常食管粘膜組織中的表達顯著低于BE組織中的表達。較正常食管粘膜BE組織中CDX-2 mRNA水平明顯升高，具有顯著性差異。
　　1.3 Real-Time PCR檢查顯示BE組織中COX-2 mRNA水平較正常食管粘膜組織明顯升高。
　　1.4對FXR表達水平及CDX-2、COX-2表達水平分別進行相關(guān)性分析，顯

15、示FXR表達與CDX-2成表達成正相關(guān)，與COX-2表達成正相關(guān)，CDX-2表達與COX-2表達成正相關(guān)。
　　2.動物模型試驗結(jié)果
　　2.1手術(shù)模型組中，與對照組相比兩種反流手術(shù)均導致食管炎癥、BE及食管腺癌的發(fā)生，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。但兩組反流性手術(shù)之間發(fā)生食管炎癥、BE及食管腺癌的幾率并無統(tǒng)計學意義，與單純膽汁反流相比混合反流并未增加BE發(fā)生率(x2=0.0565，p＞0.05)。但是在非手術(shù)模型組中，與對照組相比喂

16、食膽汁酸組與喂食胃酸及胃蛋白酶組均可導致食管炎癥及BE發(fā)生，而且兩組之間導致BE(x2=4.83，p＜0.05)發(fā)生的幾率具有明顯差異。
　　2.2同人體組織一樣，F(xiàn)XR、CDX-2及Mue2在診斷為BE的大鼠食管組織中高表達，在對照組中低表達或無表達。
　　2.3在手術(shù)模型組中，單純膽汁酸反流導致食管炎癥發(fā)生率為80％，混合反流發(fā)生率為90.5％，兩者相比無統(tǒng)計學意義(x2=0.04，p＞0.05)。但是在非手術(shù)模型組中膽

17、汁酸飼喂較加入胃蛋白酶的酸性液體飼喂導致食管炎癥的發(fā)生率有明顯不同(x2=8.96，p＜0.01)。在兩種返流手術(shù)組及膽汁酸飼喂組中檢測到IL-6和TNF-a的水平明顯升高，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。
　　2.4通過Semi-quantitative RT-PCR法測得兩種反流手術(shù)組及膽汁酸飼喂組中CDX-2和Muc2表達水平升高，且具有統(tǒng)計學意義，并與免疫組化結(jié)果一致。作為細胞分化增生的標記Bmp4，Kit19及Tff2表達水平在兩種

18、反流手術(shù)組及膽汁酸飼喂組中也升高，結(jié)果具有顯著性差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　FXR在BE中表達較正常食管粘膜組織明顯升高。BE組織中CDX-2、Muc2和COX-2表達明顯升高，并與FXR表達正相關(guān)，通過成功建立起兩種動物模型并研究證實膽汁酸而非胃酸是BE發(fā)生中的主要因素，膽汁酸及其受體導致BE的發(fā)生與其引發(fā)食管的炎性反應(yīng)有關(guān)，引起炎性反應(yīng)介質(zhì)IL-6和TNF-a高表達，并導致相應(yīng)的分化增生基因高表達，最終導致B