血小板源外泌小體中microRNAs作為預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的機(jī)制研究.pdf

1、目的:冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦峭{我國人民生命健康的重要疾病之一，急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)是冠心病的最嚴(yán)重并發(fā)癥，致殘率和致死率高。雖然早期診斷和再灌注治療對(duì)ACS患者的預(yù)后帶來很大改善，但是對(duì)于這種急性發(fā)病的疾病，臨床仍然缺乏有效預(yù)測(cè)ACS的生物標(biāo)志物。血小板在ACS中發(fā)揮重要作用，高反應(yīng)性的血小板和ACS發(fā)生相關(guān)，但是體外血小板功能實(shí)驗(yàn)并不能完全反映體內(nèi)血小板功能，因此，準(zhǔn)確反映體內(nèi)血小板激活狀態(tài)的標(biāo)志物可能是預(yù)測(cè)A

2、CS的重要方向。雖然已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)icroRNAs(miRNAs)和血小板功能的研究，但是血漿外泌小體中miRNAs作為體內(nèi)血小板活性和預(yù)測(cè)急性心血管事件標(biāo)志物的價(jià)值尚無研究。因此，本課題的研究目的是(1)通過對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE敲除（ApoE-/-）小鼠進(jìn)行頸動(dòng)脈雙狹窄手術(shù)(tandem stenosis，TS)，建立動(dòng)脈粥樣硬化血栓模型;(2)研究血栓形成之前血小板激活相關(guān)miR-223、miR-339和miR-21在血漿外泌

3、小體中的變化;(3)以及這些miRNAs在血栓模型血漿外泌小體中和體外凝血酶激活的血小板源外泌小體中的表達(dá)水平一致性;(4)凝血酶激活的血小板源外泌小體在動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成中的作用，其對(duì)斑塊血管平滑肌細(xì)胞(SMCs)的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:ApoE-/-小鼠(n=55)高脂飼料喂養(yǎng)六周，進(jìn)行雙狹窄(TS)手術(shù)(n=40)和sham手術(shù)(n=15)，術(shù)后四周行血管超聲檢查TS組管腔血流情況，并經(jīng)左側(cè)頸靜脈取血，術(shù)后七周取材，行病理

4、切片檢查血栓形成情況。分別將TS組發(fā)生血栓小鼠和sham組小鼠的術(shù)后四周血漿匯集，通過差速超速離心法提取血漿外泌小體，萃取其中的miRNAs，逆轉(zhuǎn)錄成cDNAs后進(jìn)行熒光定量實(shí)時(shí)PCR，cel-miR-39作為內(nèi)參，以ΔΔCT法比較兩組間miR-223、miR-339和miR-21的表達(dá)差異。采集健康志愿者和野生型(WT)小鼠靜脈血，提取并純化血小板，分別用凝血酶(1 U/ml)和PBS對(duì)照處理血小板，37℃孵育1小時(shí)，通過差速超速離心

5、法提取血小板源外泌小體，比較凝血酶和PBS誘導(dǎo)的人和小鼠血小板源外泌小體中miR-233、miR-339和miR-21的表達(dá)差異。提取并分離VVT小鼠（4-6只）主動(dòng)脈血管，進(jìn)行主動(dòng)脈SMCs培養(yǎng)。PKH26熒光素標(biāo)記凝血酶誘導(dǎo)的血小板源外泌小體進(jìn)行SMCs攝取外泌小體實(shí)驗(yàn)，通過激光共聚焦顯微鏡分析SMCs攝取外泌小體的濃度、時(shí)間曲線。根據(jù)外泌小體在體外SMCs的代謝時(shí)間，檢測(cè)SMCs攝取外泌小體后的miR-223、miR-339和mi

6、R-21的變化。通過DAVID Tools用來分析這些miRNAs預(yù)測(cè)靶基因的富集通路，在RNA水平篩查這些變化的miRNAs可能調(diào)控SMCs的靶基因，并在蛋白水平通過激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)免疫熒光表達(dá)量變化，并對(duì)體內(nèi)血栓節(jié)段進(jìn)行驗(yàn)證。通過Ki-67免疫熒光和TUNEL染色分析血小板源外泌小體對(duì)SMCs的增殖、凋亡的作用。
　　結(jié)果:(1)TS組小鼠的血栓發(fā)生率37.5％(15/40)，其中斑塊潰瘍占35％（14/40），斑塊破裂占

7、2.5％(1/40);血管壁內(nèi)膜中膜比在Sham組、TS組近端、TS組血栓段和TS組遠(yuǎn)端分別為:0.119±0.029 vs0.504±0.038 vs1.078±0.072 vs1.195±0.116，p＜0.001; SMCs的Ki-67的熒光信號(hào)強(qiáng)度在sham組、TS近端、血栓節(jié)段和TS遠(yuǎn)端的表達(dá)量分別為:1.002±0.027 vs3.102±0.357 vs2.837±0.063vs3.120±0.403，p=0.001;TU

8、NEL信號(hào)在sham組、TS近端、血栓節(jié)段和TS遠(yuǎn)端的表達(dá)量分別為:0.997±0.095 vs0.945±0.091 vs5.472±1.077 vs1.727±0.242，p=0.001;TS組小鼠頸動(dòng)脈血管SMCs發(fā)生中膜向內(nèi)膜顯著遷移、細(xì)胞增殖顯著，而且血栓節(jié)段SMCs凋亡增加。(2) TS手術(shù)4周，頸動(dòng)脈超聲明確沒有發(fā)生管腔閉塞，此時(shí)血漿外泌小體miR-223、miR-339和miR-21在TS組血栓形成和sham組的表達(dá)倍數(shù)

9、分別為1.83±0.35 vs0.97±0.15，p=0.017;3.56±0.25 vs1.03±0.15，p＜0.001;2.83±0.31 vs0.98±0.18，p=0.01。(3)凝血酶對(duì)PBS處理人源血小板后，miR-233、miR-339和miR-21在血小板源外泌小體和碎片中的倍數(shù)變化分別為:2.05±0.48 vs0.17±0.04, p=0.002;1.43±0.31 vs0.28±0.07, p=0.003;1.4

10、0±0.17vs0.25±0.02，p＜0.001;凝血酶對(duì)PBS處理小鼠源血小板變化為:1.34±0.10 vs0.45±0.02, p＜0.001;1.50±0.38 vs0.40±0.05, p=0.007;1.41±0.23 vs0.47±0.12,p=0.003。(4) SMCs攝取血小板源外泌小體隨濃度增加而攝取增多，攝取時(shí)間曲線符合拋物線模式:f(x)=-0.1345x2+3.2978x-1.0153，x(h)，R2=0.

11、9906，SMCs開始攝取外泌小體的時(shí)間為0.5 h，在12.25 h達(dá)到頂峰，在24 h外泌小體被細(xì)胞代謝完全。血小板源外泌小體處理SMCs24小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)miR-223、miR-339和miR-21表達(dá)水平較PBS對(duì)照組升高倍數(shù)分別為:3.780±0.085 vs1.027±0.041，p＜0.001;3.607±0.110 vs0.993±0.047, p＜0.001;5.620±0.269 vs1.007±0.054, p＜0.

12、001。KEGG富集通路分析提示miR-223、miR-339和miR-21參與的靶基因在MAPK通路中占42個(gè)，在總排名第二位，參與調(diào)控基因數(shù)占總通路總基因的2.9％，p=5.8×10-5，具有顯著相關(guān)性，其中PDGFRβ的mRNA表達(dá)水平在血小板源外泌小體處理的SMCs中顯著降低:0.67±0.19vs1.00±0.05，p=0.048;蛋白水平下降為:0.68±0.09vs1.00±0.20，p=0.005。而且，sham組血管P

13、DGFRβ熒光信號(hào)強(qiáng)度為基線，TS組節(jié)段SMCs的PDGFRβ表達(dá)顯著升高:3.03±0.42 vs1.00±0.10，p＜0.001;但是，在血栓形成部位SMCs的PDGFRβ表達(dá)量顯著下降:2.15±0.10 vs3.92±0.28，p=0.004。Ki-67陽性細(xì)胞比例在血小板源外泌小體預(yù)處理的SMCs中比例下降:4.15±1.91％vs8.40±2.83％，p=0.047; TUNEL陽性細(xì)胞比例增加:13.35±1.45％vs

14、5.85±1.57％，p=0.025;提示血小板源外泌小體有效抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，且抑制PDGF-BB的抗細(xì)胞凋亡作用。
　　結(jié)論:血漿外泌小體中miR-223、miR-339和miR-21水平升高與預(yù)測(cè)血栓形成相關(guān)，其來源可能為血小板激活釋放增多。血小板源外泌小體抑制SMCs增殖、促進(jìn)凋亡，可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223抑制PDGFRβ表達(dá)相關(guān)。模型血栓節(jié)段PDGFRβ水平表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證血小板外泌小體在體內(nèi)動(dòng)脈粥