重組irisin抑制動脈粥樣硬化的形成及其機制研究.pdf

1、研究背景:
　　動脈粥樣硬化，一種慢性進展性的血管病，是引起冠心病、腦梗死、外周血管病的首要原因，在全世界范圍內具有很高的發(fā)病率和致死率。它是由多因素共同作用引起的，主要危險因素有高血壓、高血脂、大量吸煙，還有糖尿病、肥胖和遺傳因素等。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制復雜，目前尚未完全闡明，其中內皮功能紊亂和炎癥起著至關重要的作用。
　　內皮細胞通過其細胞間緊密連接的復合體，在血液和組織之間形成了一個選擇性的透過屏障，所以內皮的完整性

2、是維持血管穩(wěn)態(tài)的一個基本因素。正常內皮細胞可以調節(jié)血管緊張度及血管結構并且分泌抗凝、抗血小板物質和纖溶蛋白，防止細胞向血管壁粘附聚集，具有抗炎癥反應的作用。當受到各種有害刺激之后，病灶處的單層內皮細胞被活化而分泌粘附分子，引起白細胞粘附，進而引起血管損害。各種危險因素可引起血管內皮損傷進而導致動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。許多研究證實內皮功能失調不但是始發(fā)因素，而且是動脈粥樣硬化進展中的重要因素，具有足夠存活能力和增殖能力的內皮細胞對維持內

3、皮完整性和修復內皮損傷至關重要。所以，維持血管內皮完整性、改善和提高內皮功能足治療和預防動脈粥樣硬化的關鍵。
　　近年來骨骼肌已經被確定為是一個內分泌器官。由骨骼肌在運動中或者運動后隨即分泌的細胞因子，被稱為肌因子，介導了鍛煉對代謝和心血管系統產生的一些有益作用。Irisin，一種新發(fā)現的肌因子，是運動后由骨骼肌產生的。它主要通過促進產熱基因解偶聯蛋白的表達促進白色脂肪棕色化，從而增加能量消耗、調節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，與肥胖、胰島素抵抗等

4、密切相關。最近，越來越多的研究證實，irisin可以改善肥胖、2型糖尿病、心血管疾病患者的內皮功能。但是，irisin在動脈粥樣硬化斑塊形成中的作用及其機制，尚未有報道。
　　研究目的:
　　1.通過建立小鼠動脈粥樣硬化模型，研究irisin對動脈粥樣硬化形成的影響。
　　2.通過體內、外實驗研究irisin對內皮細胞增殖、炎癥、凋亡的影響，并闡明其分子機制。
　　研究方法:
　　1.表達與純化人重組iri

5、sin蛋白。
　　2.建立兩種小鼠動脈粥樣硬化模型:單純高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠模型和頸總動脈部分結扎ApoE-/-小鼠模型。
　　單純高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠模型:將16只8周齡的ApoE-/-小鼠，均給予高脂飼料喂養(yǎng)，在喂養(yǎng)的第四周將小鼠隨機分成兩組，每組8只，分別給予0.5μg/g體重/天irisin和等量生理鹽水腹腔注射。在喂養(yǎng)12周后，取主動脈和主動脈根部用4％多聚甲醛固定。
　　頸總動脈部分

6、結扎ApoE-/-小鼠模型:將10只8周齡的ApoE-/-小鼠行左側頸總動脈部分結扎，結扎后隨機分成兩組，每組5只，分別給予0.5μg/g體重/天irisin和等量生理鹽水腹腔注射，術后4周取左側頸總動脈用4％多聚甲醛固定。
　　3.油紅O染色檢測irisin對小鼠主動脈及主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊形成的影響;HE染色檢測irisin對小鼠頸總動脈新生內膜形成的影響。
　　4.CD31、Ki67標記的免疫熒光染色檢測iris

7、in對血管內皮增殖的影響。
　　5.培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。
　　6.BrdU免疫熒光標記法、CCK8法、MTT法檢測irisin對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響。
　　7.microRNA(miRNA)基因芯片分析篩查irisin處理人臍靜脈內皮細胞后差異表達的miRNA。
　　8.細胞、頸總動脈RNA提取及qRT-PCR檢測相關microRNA、mRNA的表達。
　　9.Western blot

8、檢測irisin處理后人臍靜脈內皮細胞DLK1、p-ERK、p-eNOS及炎癥、凋亡相關蛋白的表達。
　　10.免疫組織化學染色檢測irisin對血管炎癥的影響。
　　11.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測irisin對小鼠血清炎癥因子水平的影響。
　　12.TUNEL熒光標記法檢測irisin對血管內皮細胞凋亡的影響。
　　13.流式細胞術檢測irisin對人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響。
　　14.用脂質

9、體Lipofectamine2000將microRNA126-5p(miR126-5p)的抑制劑和Dlk1的小干擾RNA(siRNA)轉染到人臍靜脈內皮細胞。
　　15.用50μ1含有0.1mg miR126-5p拮抗劑的F-127普郎尼克膠放在小鼠結扎后的頸總動脈的外膜周圍，將miR126-5p拮抗劑轉染到頸總動脈內。
　　16.統計學分析:本研究中所有實驗重復3次及3次以上。兩組之間比較采用Student's t檢驗，多

10、組之間比較采用單因素方差分析后Student-Newman-Keuls檢驗。P＜0.05被認為差異有統計學意義。
　　研究結果:
　　1.重組irisin可以抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成:
　　(1)高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠腹腔注射irisin8周，油紅O染色結果顯示:irisin可以抑制主動脈和主動脈根部粥樣斑塊的形成。
　　(2)左側頸總動脈部分結扎的小鼠腹腔注射irisin4周，HE染色結果顯示:ir

11、isin可以抑制頸總動脈斑塊的形成。
　　2.Irisin促進血管內皮細胞的增殖:
　　免疫熒光結果顯示irisin可以增加頸總動脈表達Ki67的內皮細胞數量。
　　3.Irisin通過上調miR126-5p促進人臍靜脈內皮細胞的增殖:
　　(1) BrdU免疫熒光標記結果顯示irisin促進HUVEC增殖。
　　(2) CCK8實驗的結果顯示，與對照組相比，20 nM的irisin使HUVEC增殖了約1.

12、26倍。
　　(3)microRNA基因芯片及qRT-PCR結果顯示irisin可以使HUVEC中miR126-5p的表達顯著增加。
　　(4) miR126-5p抑制劑抑制irisin誘導的miR126-5p表達后，BrdU免疫熒光染色和CCK8實驗結果顯示，miR126-5p抑制劑抑制了irisin誘導的HUVEC的增殖。
　　4.Irisin通過激活ERK信號通路促進miR126-5p表達:
　　(1) W

13、estern blot結果顯示，irisin可以使人臍靜脈內皮細胞中磷酸化的ERK蛋白水平升高，ERK通路的抑制劑U0126可以抑制irisin誘導的ERK磷酸化。
　　(2) qRT-PCR結果顯示ERK通路的抑制劑U0126可以抑制irisin引起的miR126-5p表達。
　　(3)Western blot結果顯示miR126-5p抑制劑對irisin引起的ERK磷酸化無影響。5.Dlk1是irisin誘導的miR12

14、6-5p的靶基因:
　　(1)qRT-PCR結果顯示irisin可以使HUVEC中Dlk1的表達顯著增加，ADAM9、MMP7與SDF-1α表達未受影響。
　　(2) Western blot結果顯示，irisin可以使HUVEC中Dlk1蛋白水平下降，miR126-5p抑制劑可以逆轉irisin對Dlk1表達的抑制作用。
　　(3) CCK8實驗的結果顯示Dlk1的小干擾RNA可以逆轉miR126-5p抑制劑對iri

15、sin誘導的HUVEC增殖的抑制作用。
　　6.抑制miR126-5p表達減弱了irisin對頸總動脈斑塊形成的抑制作用和對內皮細胞增殖的促進作用:
　　(1) qRT-PCR結果顯示腹腔注射irisin4周可以使小鼠頸總動脈miR126-5p的表達增加約2.78倍，miR126-5p拮抗劑可以使irisin引起的小鼠頸總動脈miR126-5p的表達降低。
　　(2)左側頸總動脈部分結扎的小鼠腹腔注射irisin4周，

16、HE染色結果顯示:miR126-5p拮抗劑可以減弱irisin對頸總動脈斑塊形成的抑制作用。
　　(3)免疫熒光結果顯示miR126-5p拮抗劑可以抑制irisin引起的頸總動脈表達Ki67內皮細胞數量的增加。
　　7.irisin抑制頸總動脈斑塊中炎性細胞的浸潤:免疫組織化學染色結果顯示irisin可以減少頸總動脈斑塊中CD68+巨噬細胞和CD3+T細胞的面積。
　　8.irisin抑制頸總動脈斑塊中炎癥相關基因的表

17、達:
　　(1) qRT-PCR結果顯示irisin可以使頸總動脈斑塊中IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平減少。
　　(2) ELISA結果顯示irisin可以使ApoE-/-小鼠血清中IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達減少。
　　9.irisin通過抑制ROS/p38 MAPK/NF-κB信號通路抑制ox-LDL誘導的HUVECs炎癥反應:
　　(1)qRT-

18、PCR結果顯示irisin可以抑制ox-LDL刺激的HUVECs中IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平。
　　(2) Western blot結果顯示irisin抑制了ox-LDL誘導的p38 MAPK磷酸化。
　　(3) Western blot結果顯示irisin抑制了ox-LDL誘導的NF-κB p65和磷酸化的NF-κB p65表達，并且使磷酸化的NF-κB p65/NF-κB p65比值降

19、低。
　　(4) Western blot結果顯示與ox-LDL處理組相比，irisin可以降低細胞核NF-κBp65的水平，提高細胞漿NF-κB p65的水平，抑制NF-κB p65的核移位。
　　(5) DCFH-DA實驗結果顯示irisin抑制了ox-LDL誘導的HUVECs內ROS表達。
　　10.irisin抑制頸總動脈斑塊中細胞凋亡:
　　TUNEL熒光標記實驗結果顯示irisin可以減少頸總動脈斑塊

20、中細胞凋亡的數量。
　　11.irisin減少了ox-LDL誘導的HUVECs凋亡:流式細胞術結果顯示，irisin有效減少了ox-LDL誘導的HUVEC凋亡。
　　12.Irisin上調了Bcl-2的表達，下調了Bax和Caspase-3的表達:Westem blot結果顯示，irisin可以使Bcl-2的表達升高，Bax和Caspase-3的表達下降。
　　結論:
　　1.重組irisin可以抑制高脂喂養(yǎng)8周

21、的ApoE-/-小鼠主動脈、主動脈根部及左側頸總動脈部分結扎的ApoE-/-小鼠頸總動脈中動脈粥樣硬化斑塊的形成。
　　2.體內、外實驗均發(fā)現irisin能通過上調miR126-5p促進內皮細胞增殖。
　　3.Irisin通過激活ERK信號通路上調miR126-5p的表達，進而抑制Dlk的表達。
　　4.重組irisin可以減少動脈粥樣硬化斑塊中的炎性細胞浸潤及炎性因子IL-6、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的