血清淀粉樣蛋白A加速動脈粥樣硬化斑塊形成及其致炎作用的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 心腦血管疾病已成為嚴重危害人類健康的頭號殺手，其高發(fā)病率和高致殘率帶來了諸多的社會問題。而動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多種心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，是臨床上導(dǎo)致急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndrome，ACS)發(fā)生的最主要病因。經(jīng)過多年的基礎(chǔ)和臨床研究，Ross明確提出“AS是一種慢性炎癥性疾病”，其發(fā)生發(fā)展是涉及到脂質(zhì)代謝紊亂、免疫炎癥反應(yīng)、巨噬細胞浸潤等多個因素

2、和環(huán)節(jié)的復(fù)雜病理過程。因此，深入探討影響AS病變形成的各種危險因素并尋找有效的干預(yù)靶點，預(yù)防甚至避免AS疾病的發(fā)生，成為了近年來心血管領(lǐng)域的研究熱點。
　　 人類血清淀粉樣蛋白A（serumamyloidA，SAA）是一組由同一基因編碼的多形性蛋白，包括SAA1～SAA4這四種蛋白亞型。SAA1和SAA2蛋白結(jié)構(gòu)近93％一致，在炎癥的急性反應(yīng)期中顯著上調(diào);SAA3基因則被認為是一種不能轉(zhuǎn)錄和表達的假基因;SAA4蛋白雖能夠持續(xù)表

3、達，但不參與急性炎癥反應(yīng)。研究表明，不論是在正常還是在炎癥狀態(tài)下，SAA1亞型始終是SAA的主要組分，決定著總SAA蛋白的作用水平。
　　 SAA血清水平在機體急性炎癥（如外傷、感染等）反應(yīng)過程中上升極快，短時間內(nèi)由肝臟細胞大量分泌，可超過正常值的1000倍以上，這種特性也使得SAA成為目前最敏感的炎癥標志物之一。同時，眾多的研究也發(fā)現(xiàn)，在包括肥胖、AS在內(nèi)的各種慢性炎癥病理狀態(tài)下，人類的脂肪細胞、血管內(nèi)皮細胞及單核-巨噬細胞等

4、肝外組織也能合成分泌SAA蛋白并導(dǎo)致血清SAA水平呈一定程度的升高，從而時刻準確反映著機體的慢性炎癥水平。
　　 近年來，國內(nèi)外多宗大規(guī)模臨床試驗顯示血清SAA的水平可以作為評估和預(yù)測冠心病病情嚴重程度的敏感標志物，這提示SAA與AS的發(fā)生與流行之間似乎存在著密切的聯(lián)系。隨著對SAA研究的深入，SAA的眾多生物學(xué)功能也逐漸為人們所了解。首先，SAA對單核-巨噬細胞具有較強的趨化性。其次，SAA可以作為載脂蛋白，參與膽固醇代謝并增

5、加脂質(zhì)與巨噬細胞的親和力。再次，在一系列的體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn)SAA能夠上調(diào)單核細胞趨化蛋白1(monocytechemotacticprotein-1，MCP-1)、腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)-6及IL-8等炎癥相關(guān)因子的表達。上述關(guān)于SAA生物學(xué)效能的研究結(jié)果進一步提示我們，SAA應(yīng)該在AS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用。
　　 然而，盡管近

6、年來國內(nèi)外學(xué)者在SAA與AS斑塊形成兩者關(guān)系的研究中已取得了較大進展，但仍存在一系列困擾我們的重大問題:(1)究竟SAA僅僅是AS慢性炎癥狀態(tài)的一個標志物，還是AS發(fā)生過程中的一個積極的參與者？(2)如果SAA直接或者間接地參與了AS的發(fā)生，那么它發(fā)揮了何種作用？(3)SAA在AS病程中所發(fā)揮的作用又是通過哪些途徑和靶點來實現(xiàn)的？
　　 針對上述這些亟待解決的關(guān)鍵問題，本課題構(gòu)建了SAA1高表達慢病毒，成功實現(xiàn)了SAA1蛋白在實

7、驗動物體內(nèi)的穩(wěn)定高表達;同時采用ApoE-(/)-小鼠構(gòu)建AS動物模型，探討SAA在AS斑塊形成過程中所發(fā)揮的作用及其可能的機制，旨在為有效控制AS疾病的發(fā)生發(fā)展提供全新的干預(yù)靶點與治療策略。
　　 研究目的：
　　 1.明確血清SAA濃度的升高在ApoE-(/)-小鼠AS斑塊形成過程中所發(fā)揮的作用。
　　 2.探討SAA在AS斑塊內(nèi)的沉積及表達情況以及SAA對AS斑塊內(nèi)巨噬細胞水平及分布的影響。
　　

8、3.探討血清SAA濃度的升高對促AS發(fā)生的相關(guān)炎癥因子表達水平的影響。
　　 研究方法
　　 1.動物模型的建立
　　 90只8周齡雄性ApoE-(/)-小鼠隨機分為SAA1高表達慢病毒干預(yù)組（lenti-SAA組）、空載體慢病毒對照組（lenti-null組）和生理鹽水對照組（salinecontrol組）三組。本課題所使用的小鼠SAA1高表達慢病毒購自上海Invitrogen公司。lenti-SAA組每只小鼠

9、尾靜脈注射107TU的慢病毒;作為對照，lenti-null組和salinecontrol組分別注入相應(yīng)體積的空載體慢病毒和生理鹽水。為避免高脂飲食喂養(yǎng)對AS斑塊形成所產(chǎn)生的影響，實驗全程采用普通飲食（5％脂質(zhì)，不添加膽固醇）喂養(yǎng)實驗動物，期間使用小動物超聲監(jiān)測斑塊形成時間、面積。普通飲食喂養(yǎng)14周后，小鼠隔夜禁食后稱重，麻醉后處死并取血，離心后取血清凍存。隨機處死各組中的小鼠經(jīng)灌流和固定后取材，將小鼠心臟和主動脈與周圍組織分離并凍存。

10、
　　 2.血液生化指標檢測
　　 檢測血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。同時，使用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)測定血清總SAA、IL-6、TNF-α水平。
　　 3.主動脈表面AS病變?nèi)旧?br>　　 收集自主動脈弓到腹主動脈分叉處的主動脈節(jié)段，去除結(jié)締組織成分后，縱

11、剖后展開固定于蠟板上并行油紅O染色，AS斑塊區(qū)域?qū)⒈蝗境杉t色。AS的病變程度用油紅O陽性染色區(qū)域占整個主動脈表面積的百分比表示。
　　 4.主動脈根部AS病灶分析
　　 對主動脈竇做平行于瓣環(huán)的橫截位冰凍切片，對斑塊內(nèi)結(jié)構(gòu)和成分進行染色，包括蘇木素-伊紅(H&E)染色、油紅O染色等，并進行量化分析，AS的病變程度用總的斑塊面積占整個主動脈瓣環(huán)面積的百分比表示。
　　 5.免疫組織化學(xué)染色
　　 取主動脈竇

12、冰凍切片，進行巨噬細胞、MCP-1的免疫組織化學(xué)染色，觀察兩者在AS斑塊內(nèi)的表達水平。
　　 6.免疫熒光染色
　　 取主動脈竇冰凍切片，進行SAA、巨噬細胞及血管細胞粘附分子1(vascularcelladhesionmolecule-1，VCAM-1)的免疫熒光染色，觀察各個指標在AS斑塊內(nèi)的表達水平，并進一步明確SAA與巨噬細胞在斑塊內(nèi)分布的相關(guān)性。
　　 7.實時定量PCR(real-timePCR)

13、r>　　 通過Trizol法提取小鼠主動脈總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，以β-actin為參照，采用real-timePCR技術(shù)檢測MCP-1和VCAM-1的mRNA表達水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.體重及血液生化指標檢測
　　 實驗結(jié)束時lenti-SAA組、lenti-null組和salinecontrol組三組之間的體重、TG、TC、HDL-C及LDL-C水平未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，這說明采用普通飲食

14、喂養(yǎng)實驗動物，成功避免了高脂飲食喂養(yǎng)所造成的血脂異常對AS斑塊形成所產(chǎn)生的影響。lenti-null組和salinecontrol組的血清SAA、IL-6及TNF-α水平未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，這說明SAA1高表達慢病毒的注射并未引起小鼠機體的炎癥反應(yīng)。因此，對本實驗結(jié)果的觀察重點聚焦于lenti-SAA組與lenti-null組之間實驗結(jié)果的對比。lenti-SAA組較lenti-null組的SAA、IL-6及TNF-α水平顯

15、著升高(P＜0.01)，這證明了SAA1高表達慢病毒的注射在小鼠體內(nèi)能夠有效的高表達，保證了血清SAA水平的穩(wěn)定升高;而SAA水平的升高又進一步導(dǎo)致了IL-6及TNF-α水平的升高，加重了機體的炎癥水平。
　　 2.AS病變嚴重程度分析
　　 主動脈AS病變大體染色顯示lenti-SAA組較lenti-null組的AS斑塊面積顯著增加(P＜0.01)，這與對主動脈竇AS病變區(qū)域行H&E及油紅O染色所得到的結(jié)果一致(P＜0

16、.01)，說明血清SAA水平的升高加速了AS斑塊的形成。
　　 3.AS斑塊內(nèi)SAA與巨噬細胞表達情況
　　 對主動脈竇AS斑塊內(nèi)SAA、巨噬細胞行免疫組織化學(xué)和熒光染色發(fā)現(xiàn)，lenti-SAA組較lenti-null組的巨噬細胞數(shù)目顯著增多(P＜0.01),且巨噬細胞與SAA在斑塊內(nèi)部的分布位置相互重疊，密切相關(guān)。
　　 4.AS斑塊內(nèi)MCP-1的表達情況
　　 real-timePCR、免疫組織化學(xué)染

17、色的結(jié)果顯示，與lenti-null組相比，lenti-SAA組AS斑塊區(qū)域MCP-1的mRNA及蛋白表達水平顯著上調(diào)(P＜0.01)，這提示血清SAA水平的升高通過上調(diào)AS斑塊內(nèi)MCP-1的表達，增強了對巨噬細胞的趨化作用。
　　 5.AS斑塊內(nèi)VCAM-1的表達情況
　　 通過real-timePCR、免疫熒光染色技術(shù)顯示，與lenti-null組相比，lenti-SAA組AS斑塊區(qū)域VCAM-1的mRNA及蛋白表達

18、水平顯著上調(diào)(P＜0.01)，這說明血清SAA水平的升高增加了AS病變區(qū)域主動脈內(nèi)皮細胞VCAM-1的表達，從而增強了對巨噬細胞的粘附作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究應(yīng)用SAA1高表達慢病毒首次成功地實現(xiàn)了SAA1蛋白在實驗動物體內(nèi)的持續(xù)穩(wěn)定高表達。
　　 2.本研究采用普通飲食喂養(yǎng)ApoE-(/)-小鼠，避免了高脂飲食喂養(yǎng)對研究AS斑塊形成所產(chǎn)生的影響。
　　 3.血清SAA水平的升高，通過上調(diào)I