蛋白激酶C參與調(diào)控青桿花粉管的極性生長(zhǎng).pdf

1、細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)可逆磷酸化，即蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化是調(diào)節(jié)酶活性的兩個(gè)主要翻譯后反映，是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的生理調(diào)節(jié)反應(yīng)，并廣泛參與細(xì)胞內(nèi)各種生理過(guò)程。近年來(lái)，在動(dòng)物細(xì)胞和酵母的研究中表明，蛋白激酶C主要是通過(guò)調(diào)節(jié)鈣通道活性、微絲骨架和細(xì)胞壁建成等方面調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)建成，如極性生長(zhǎng)，但有關(guān)蛋白激酶C在花粉管極性生長(zhǎng)過(guò)程中的作用機(jī)理卻鮮為報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，利用花粉的離體培養(yǎng)和最佳培養(yǎng)基的篩選及其統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、透射電鏡觀察、蛋白免疫印跡、免疫熒光標(biāo)

2、記以及顯微紅外光譜分析等技術(shù)，研究了蛋白激酶C抑制劑Bisindolymaleimide(BIM)對(duì)裸子植物青桿(Pciea wilsonii Mast．)花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)速率、花粉管形態(tài)、花粉管超微結(jié)構(gòu)、微絲骨架以及細(xì)胞壁成分等方面的影響，旨在從細(xì)胞水平上探討蛋白激酶C在花粉管極性生長(zhǎng)模式的建立和維持中的作用。主要研究結(jié)果如下： 1．根據(jù)對(duì)青桿花粉萌發(fā)率和生長(zhǎng)狀況的觀察統(tǒng)計(jì)，確定了離體花粉萌發(fā)和生長(zhǎng)的優(yōu)化條件，其培養(yǎng)基的蔗

3、糖、硼酸和氯化鈣的最適含量分別為：12％，0.02％和0.03％。 2．應(yīng)用免疫印跡技術(shù)，我們利用單克隆抗PKC抗體在青桿花粉管的蛋白提取物中檢測(cè)出了一條55 kDa的蛋白條帶，證明了PKC確實(shí)存在于青桿花粉管中，相比之下，PKC抑制劑BIM處理導(dǎo)致花粉管中PKC含量在降低。PKC的活力測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)了免疫印跡結(jié)果。 3．Fluo-3/AM標(biāo)記結(jié)果表明對(duì)照花粉管頂端普遍存在一個(gè)極陡的Ca<'2+>梯度，而BIM處理后Ca

4、<'2+>梯度受到破壞，說(shuō)明PKC調(diào)控花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中胞外Ca<'2+>的內(nèi)流，并參與維持花粉管頂端的Ca<'2+>梯度，顯示了在調(diào)節(jié)花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)Ca<'2+>信號(hào)調(diào)節(jié)的重要性。 4．應(yīng)用FTTC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色顯示，我們發(fā)現(xiàn)在對(duì)照花粉管中束狀微絲以與長(zhǎng)軸平行的方向從花粉粒一直延伸到花粉管亞頂端，而花粉管頂端微絲的分布成不規(guī)則狀。BIM處理導(dǎo)致微絲發(fā)生解聚，且解聚狀態(tài)依賴于生長(zhǎng)受抑制的程度，通常抑制生長(zhǎng)越嚴(yán)重，微絲解聚程

5、度越高。 5 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組的花粉管中，細(xì)胞器呈極性分布，頂端有明顯的分泌囊泡透明區(qū)；而BIM處理導(dǎo)致花粉管中細(xì)胞器極性分布模式破壞，頂端分泌囊泡的數(shù)量減少，透明區(qū)消失，液泡大量聚集在頂端，并導(dǎo)致高爾基體解體和線粒體膜膨脹。這些結(jié)果充分地說(shuō)明了抑制劑處理破壞了花粉管的分泌系統(tǒng)。 6．利用單克隆抗體JIM5和JIM7，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照花粉管中酯化果膠主要聚集于花粉管頂端，而酸性果膠則主要分布在花粉管兩側(cè)壁。熒光標(biāo)記

6、結(jié)果表明正常青桿花粉管中纖維素和胼胝質(zhì)在整個(gè)花粉管壁上均有分布。而BIM處理明顯導(dǎo)致花粉管壁上的酸性果膠、酯化果膠和纖維素含量下降以及胼胝質(zhì)在花粉管頂端的沉積。此外，我們還利用FTIR技術(shù)進(jìn)一步分析了BIM處理對(duì)花粉管壁的組分變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次表明BIM處理導(dǎo)致花粉管壁果膠組分的含量大量下降，使得花粉管壁的結(jié)構(gòu)隨之變得疏松，破壞了細(xì)胞壁的正常構(gòu)建。 綜上所述，我們可以認(rèn)為，PKC通過(guò)(1)調(diào)節(jié)質(zhì)膜Ca<'2+>通道活性參與維持花