人CD4+T淋巴細(xì)胞活化相關(guān)的miRNA的篩選和功能鑒定.pdf

1、微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22nt、內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，通過(guò)和靶mRNA的3'末端非翻譯區(qū)(3'untranslational region，3'UTR)完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)結(jié)合，使mRNA降解或抑制其翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在線蟲、果蠅、植物、哺乳動(dòng)物、甚至病毒中廣泛存在，在各個(gè)物種間具有高度的進(jìn)化保守性。miRNA在表達(dá)上具有組織和時(shí)間的特異性，是調(diào)節(jié)其他功能基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)分子，在生物體的各

2、種生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，參與生命過(guò)程中一系列重要進(jìn)程，包括發(fā)育進(jìn)程、造血過(guò)程、器官形成、凋亡、細(xì)胞增殖和腫瘤的發(fā)生。
　　適應(yīng)性免疫是免疫系統(tǒng)在進(jìn)化過(guò)程中形成的針對(duì)特定抗原物質(zhì)的高度專一性的防御機(jī)制,包括以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫和以B細(xì)胞為主的體液免疫。在這個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)中miRNA發(fā)揮著巨大的作用。盡管有研究探索了naiveCD8+T細(xì)胞，效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞和記憶性CD8+T細(xì)胞中miRNA的表達(dá)變化，但是在T細(xì)胞的活化過(guò)

3、程中差異表達(dá)的miRNA的真正的作用仍然不清楚。所以進(jìn)一步深入研究這些miRNA在T細(xì)胞活化和分化過(guò)程中的生物學(xué)功能有助于我們更好的調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
　　本課題用ExiqonmiRNA基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)了用CD3抗體和CD28抗體雙信號(hào)活化Jurkat細(xì)胞前后差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)了5種miRNA在Jurkat細(xì)胞活化后表達(dá)下調(diào)。實(shí)時(shí)定量檢測(cè)驗(yàn)證了芯片的結(jié)果。由于在已有的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，miR-181家族的成員miR-181a

4、與T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育有著密切的關(guān)系，在體外實(shí)驗(yàn)中也已證實(shí)anti-CD3抗體誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的活化會(huì)使miR-181的表達(dá)受到抑制。所以我們選擇了miR-181c作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的miRNA分子。
　　為了進(jìn)一步確實(shí)miR-181c和人CD4+T淋巴細(xì)胞活化的關(guān)系，我們用磁珠分離出正常健康人血中的CD4+T淋巴細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量證實(shí)在活化的人CD4+T淋巴細(xì)胞中miR-181c的表達(dá)也是下調(diào)的。這與ExiqonmiRNA基因表達(dá)譜芯片及

5、Jurkat細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果一致。
　　通過(guò)在網(wǎng)站http://microrna.sanger.ac.uk/和http://www.targetscan.org/上預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞活化通路的相關(guān)分子IL-2，CD69，IL1A，MAP3K3，MAP3K10，NFAT5的3'UTR有miR-181c的結(jié)合位點(diǎn)，可能為miR-181c作用的靶分子。其中IL-2的3'UTR有2個(gè)miR-181c的結(jié)合位點(diǎn)，而且在預(yù)測(cè)的靶分子的評(píng)分中排第二位

6、，說(shuō)明IL-2可能是miR-181c發(fā)揮作用的一個(gè)靶點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)的結(jié)果證實(shí)，miR-181c和IL-2的3'UTR有較明顯的結(jié)合。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們主要驗(yàn)證miR-181c和IL-2的關(guān)系。
　　我們?cè)隗w外用Jurkat細(xì)胞模擬人CD4+T淋巴細(xì)胞。將miR-181c轉(zhuǎn)染到Jurkat細(xì)胞內(nèi)，用anti-CD3抗體和anti-CD28抗體雙信號(hào)刺激活化Jurkat細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞活化的表面標(biāo)志分子CD25、C

7、D69和CD154，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，miR-181c可以部分抑制Jurkat細(xì)胞的活化。
　　將miR-181c和IL-23'UTR及其各種突變體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，結(jié)果顯示miR-181c對(duì)含有IL23'UTR全長(zhǎng)的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)有比較明顯的抑制作用，約為50％，只含有結(jié)合位點(diǎn)1的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)被抑制了約20％，而只含有結(jié)合位點(diǎn)2的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)被抑制了約2/3，說(shuō)明結(jié)合位點(diǎn)2的抑制作用更強(qiáng)。

8、>　　為了進(jìn)一步闡明IL-2是miR-181c的直接靶分子，還是miR-181c通過(guò)影響T淋巴細(xì)胞的活化間接影響了IL-2的表達(dá)水平，我們構(gòu)建了IL-2的真核表達(dá)載體。pcDNA3-IL2CDS-UTR包含IL-2的編碼區(qū)和3'UTR，而pcDNA3-IL2CDS只包含IL-2的編碼區(qū)。將這兩種IL-2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，使得原本不表達(dá)IL-2的HEK293細(xì)胞上清高表達(dá)IL-2。同時(shí)轉(zhuǎn)染合成的miR-181c分子和這兩種

9、IL-2真核表達(dá)載體到HEK293細(xì)胞中，ELISA檢測(cè)HEK293細(xì)胞上清中的IL-2，轉(zhuǎn)染miR-181c和pcDNA3-IL2CDS-UTR組的IL-2水平明顯下調(diào)，而同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-181c和pcDNA3-IL2CDS組的IL-2水平?jīng)]有顯著變化，說(shuō)明miR-181c可以通過(guò)結(jié)合IL-23'UTR抑制IL-2蛋白水平的表達(dá)。說(shuō)明IL-2是miR-181c的直接靶分子。
　　將合成的miR-181c分子轉(zhuǎn)染到人CD4+T淋巴

10、細(xì)胞內(nèi)，用雙信號(hào)刺激活化人CD4+T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞活化的表面標(biāo)志分子CD25、CD69和CD154，同樣發(fā)現(xiàn)miR-181c可以部分抑制人CD4+T淋巴細(xì)胞的活化。
　　轉(zhuǎn)染miR-181c的人CD4+T淋巴細(xì)胞被活化24h后，和對(duì)照相比，上清中IL-2的水平明顯下降，說(shuō)明miR-181c可以抑制人CD4+T淋巴細(xì)胞合成分泌IL-2。但是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)表明和未活化相比，活化組IL-2mRNA水平顯著上調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR

11、-181c并沒(méi)有下調(diào)IL-2mRNA水平。在Jurkat細(xì)胞中觀察到了同樣的現(xiàn)象。說(shuō)明由于miR-181c與IL-23'UTR相互結(jié)合是不完全互補(bǔ)的，所以miR-181c只是抑制了IL-2mRNA的翻譯，而不是降解IL-2mRNA。這與以往的文獻(xiàn)報(bào)道相符合。
　　分別給人CD4+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181c和scramble miRNA（negative control,N.C.），用雙信號(hào)刺激活化72h，用MTT檢測(cè)其細(xì)胞增殖

12、。轉(zhuǎn)染miR-181c組活化72h后，miR-181c抑制了人CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖，這可能與轉(zhuǎn)染miR-181c后IL2的表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：miR-181c與人CD4+T淋巴細(xì)胞的活化有著密切的關(guān)系，它可以抑制人CD4+T淋巴細(xì)胞的活化，同時(shí)也抑制人CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-2分子。異位表達(dá)IL-2分子的實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以直接下調(diào)IL-2分子的表達(dá)，IL-2分子是miR-181c的直接靶分子。miR-181