T淋巴細胞活化相關的microRNA的篩選、靶分子的預測、構建和鑒定.pdf

1、microRNA簡稱miRNA，是一種21-25個堿基的非編碼小分子RNA，它廣泛存在于真核生物中。miRNA基因的初級轉錄產(chǎn)物(pri-miRNA)在細胞核中被RNaseⅢDrosha切割成為前體miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA在轉運蛋白exportin-5的作用下由核內(nèi)轉到胞質中，然后由另一種RNaseⅢDicer進一步切割產(chǎn)生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與其他蛋白質一起組成RISC(RNA-induc

2、edsilencingcomplex)復合體，從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。miRNA廣泛存在于動物、植物以及病毒中，第一個被確認的是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRNAs。截止2008年9月，登載在SangermiRNA數(shù)據(jù)miRBase12.0(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中的miRNA總數(shù)已

3、達8273種。大量研究表明，miRNA參與了包括細胞分裂增殖、分化與發(fā)育以及代謝等許多重要的生物學過程。
　　哺乳動物的免疫系統(tǒng)在抵抗感染、自身穩(wěn)定和免疫監(jiān)視方面發(fā)揮重要作用。為達到免疫應答和免疫耐受的恰當平衡,免疫反應的起始、終止和反應強度必須被嚴謹調(diào)節(jié)。相對于轉錄因子全開或全關的調(diào)節(jié)方式，miRNAs更適合對免疫系統(tǒng)進行精細調(diào)節(jié)和定量調(diào)節(jié)，因為它們通過非常短的作用位點進行調(diào)節(jié)，在作用位點一個或少數(shù)幾個堿基對就能起到關鍵作用，并

4、且由于它們在進化過程中易于突變，從而為生物體提供了隨病原進化同時發(fā)揮作用的基因調(diào)節(jié)子儲存庫。最近研究表明miRNAs確實在免疫系統(tǒng)的精細調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。深入理解miRNA調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的機制，不僅有助于鑒定調(diào)節(jié)免疫反應的新靶標,而且有助于建立有效的miRNA新療法。
　　在本實驗中，為了探詢T細胞活化是否對miRNA的表達譜產(chǎn)生影響，我們應用ExiqonmiRNA基因表達譜芯片，以活化的Jurkat細胞（用CD3抗體和CD28抗

5、體雙信號活化）為實驗組，未活化Jurkat細胞為對照組，分析了二者miRNA表達譜的差異，找出表達水平顯著改變（下調(diào)超過2倍）的miRNA。芯片結果顯示，與未活化的Jurkat細胞相比，活化的Jurkat細胞中有一些miRNA表達水平明顯下調(diào)。我們對部分下調(diào)的miRNA進行了實時定量PCR檢測來驗證芯片的結果。
　　為了進一步確實miRNA和人T淋巴細胞活化的關系，我們通過miRanda來預測miRNA在T細胞活化過程中的潛在作用

6、位點，并在此基礎之上進行驗證。預測結果表明：miR-33b和miR-568對T細胞活化過程中的許多重要分子都有作用位點，這些分子包括CD96、CD28、NF1、CD3G、IL2RA、IL2RB、NFAT5、CD8B、RAC3等。其中，miR-568的靶分子NFAT5在預測的靶分子的評分中，分數(shù)最高，并且miR-568和NFAT5有4個潛在作用的位點，說明NFAT5很有可能是miR-568針對的一個靶分子。
　　為了驗證這些預測的靶

7、分子是否為miRNA真正作用的靶標，我們將預測的靶分子的3′UTR序列中miRNA結合位點上下游的部分片段導入pGL3-MCS2熒光素酶表達載體中，構建雙熒光素酶報告系統(tǒng)，然后分別將miRNA真核表達質?；蚝铣傻膍iRNA以及對照pcDNA3或合成的陰性對照scramblemiRNA（N.C.）與構建好的靶分子真核表達載體、質粒pRL-TK共轉染HEK293細胞，觀察熒光素酶活性的變化。結果顯示：miR-568對NFAT5有比較明顯的抑