外周血CD4+T細(xì)胞DNA甲基化異常的研究.pdf

1、第一部分自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞DNA總體甲基化異常的研究
　　 目的：研究自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞DNA總體甲基化狀態(tài)，從而探討自身免疫糖尿病患者的表觀遺傳學(xué)改變。
　　 方法：密度梯度離心法分離20例經(jīng)典1型糖尿病患者、15例成人隱匿性自身免疫糖尿病患者和19例正常對照的外周血單個核細(xì)胞，磁珠法分選CD4+T細(xì)胞，抽提DNA，然后用總體甲基化定量試劑盒檢測兩組自身免疫糖尿病患者和正常對照C

2、D4+T細(xì)胞的DNA總體甲基化水平。
　　 結(jié)果：與正常對照組相比，經(jīng)典1型糖尿病患者CD4+T細(xì)胞基因組DNA總體甲基化水平增高(P=0.047);成人隱匿性自身免疫糖尿病患者CD4+T細(xì)胞基因組DNA總體甲基化水平較正常對照組相比也增高(P=0.046)。
　　 結(jié)論：自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞DNA呈現(xiàn)總體高甲基化水平。
　　 第二部分自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞甲基化相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)

3、的研究
　　 目的：研究自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）和甲基結(jié)合蛋白(MBD)的表達(dá)水平。
　　 方法：密度梯度離心法分離20例經(jīng)典1型糖尿病患者、15例成人隱匿性自身免疫糖尿病患者和19例正常對照的外周血單個核細(xì)胞，磁珠法分選CD4+T細(xì)胞，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)和甲基結(jié)合蛋白(MBD)的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果

4、：與正常對照相比，經(jīng)典1型糖尿病患者CD4+T細(xì)胞DNMT3b的mRNA水平明顯增高(P=0.038)，MBD0mRNA表達(dá)水平明顯降低（P=0.042）;成人隱匿性自身免疫糖尿病患者CD4+T細(xì)胞DNMT3b的mRNA水平也明顯增高(P=0.040)，MBD的mRNA水平無明顯差異。同時，經(jīng)典1型糖尿病患者CD4+T細(xì)胞DNA總體甲基化水平與DNMT3b mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.567，P=0.009）。成人隱匿性自身免疫糖

5、尿病患者的DNA總體甲基化水平也與DNMT3b mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.422，P=0.032）。
　　 結(jié)論：自身免疫糖尿病患者CD4+T細(xì)胞DNA甲基化相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)異常，與自身免疫糖尿病患者CD4+T細(xì)胞DNA總體甲基化異常狀態(tài)相關(guān)。
　　 第三部分自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)及其調(diào)節(jié)序列甲基化狀態(tài)的研究
　　 目的：研究自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞自

6、身免疫反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)及其調(diào)節(jié)序列的甲基化狀態(tài)。
　　 方法：密度梯度離心法分離20例經(jīng)典1型糖尿病患者、15例成人隱匿性自身免疫糖尿病患者和19例正常對照的外周血單個核細(xì)胞，磁珠法分選CD4+T細(xì)胞，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測Foxp3、ICOS、CTLA-4、IFNG、IL10、 IL2、IL17和IL4的mRNA表達(dá)水平;流式細(xì)胞檢測外周血單個核細(xì)胞中CD11a及CD40L在CD4+T細(xì)胞中的

7、表達(dá)水平;western-blot檢測Foxp3蛋白表達(dá)水平;亞硫酸氫鈉測序檢測Foxp3基因調(diào)節(jié)序列的甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果：與正常對照組相比，經(jīng)典1型糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)下降，且其基因調(diào)節(jié)序列呈明顯的高甲基化(P=0.046);成人隱匿性自身免疫糖尿病患者CD4+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)也降低，其基因調(diào)節(jié)序列亦呈明顯的高甲基化(P=0.047)。
　　 結(jié)論：自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)