外周血CD4+T細(xì)胞DNA甲基化異常的研究.pdf

1、第一部分自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞DNA總體甲基化異常的研究
　　 目的：研究自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞DNA總體甲基化狀態(tài)，從而探討自身免疫糖尿病患者的表觀遺傳學(xué)改變。
　　 方法：密度梯度離心法分離20例經(jīng)典1型糖尿病患者、15例成人隱匿性自身免疫糖尿病患者和19例正常對(duì)照的外周血單個(gè)核細(xì)胞，磁珠法分選CD4+T細(xì)胞，抽提DNA，然后用總體甲基化定量試劑盒檢測(cè)兩組自身免疫糖尿病患者和正常對(duì)照C

2、D4+T細(xì)胞的DNA總體甲基化水平。
　　 結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，經(jīng)典1型糖尿病患者CD4+T細(xì)胞基因組DNA總體甲基化水平增高(P=0.047);成人隱匿性自身免疫糖尿病患者CD4+T細(xì)胞基因組DNA總體甲基化水平較正常對(duì)照組相比也增高(P=0.046)。
　　 結(jié)論：自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞DNA呈現(xiàn)總體高甲基化水平。
　　 第二部分自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞甲基化相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)

3、的研究
　　 目的：研究自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）和甲基結(jié)合蛋白(MBD)的表達(dá)水平。
　　 方法：密度梯度離心法分離20例經(jīng)典1型糖尿病患者、15例成人隱匿性自身免疫糖尿病患者和19例正常對(duì)照的外周血單個(gè)核細(xì)胞，磁珠法分選CD4+T細(xì)胞，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)和甲基結(jié)合蛋白(MBD)的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果

4、：與正常對(duì)照相比，經(jīng)典1型糖尿病患者CD4+T細(xì)胞DNMT3b的mRNA水平明顯增高(P=0.038)，MBD0mRNA表達(dá)水平明顯降低（P=0.042）;成人隱匿性自身免疫糖尿病患者CD4+T細(xì)胞DNMT3b的mRNA水平也明顯增高(P=0.040)，MBD的mRNA水平無明顯差異。同時(shí)，經(jīng)典1型糖尿病患者CD4+T細(xì)胞DNA總體甲基化水平與DNMT3b mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.567，P=0.009）。成人隱匿性自身免疫糖

5、尿病患者的DNA總體甲基化水平也與DNMT3b mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.422，P=0.032）。
　　 結(jié)論：自身免疫糖尿病患者CD4+T細(xì)胞DNA甲基化相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)異常，與自身免疫糖尿病患者CD4+T細(xì)胞DNA總體甲基化異常狀態(tài)相關(guān)。
　　 第三部分自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)及其調(diào)節(jié)序列甲基化狀態(tài)的研究
　　 目的：研究自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞自

6、身免疫反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)及其調(diào)節(jié)序列的甲基化狀態(tài)。
　　 方法：密度梯度離心法分離20例經(jīng)典1型糖尿病患者、15例成人隱匿性自身免疫糖尿病患者和19例正常對(duì)照的外周血單個(gè)核細(xì)胞，磁珠法分選CD4+T細(xì)胞，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Foxp3、ICOS、CTLA-4、IFNG、IL10、 IL2、IL17和IL4的mRNA表達(dá)水平;流式細(xì)胞檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD11a及CD40L在CD4+T細(xì)胞中的

7、表達(dá)水平;western-blot檢測(cè)Foxp3蛋白表達(dá)水平;亞硫酸氫鈉測(cè)序檢測(cè)Foxp3基因調(diào)節(jié)序列的甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，經(jīng)典1型糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)下降，且其基因調(diào)節(jié)序列呈明顯的高甲基化(P=0.046);成人隱匿性自身免疫糖尿病患者CD4+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)也降低，其基因調(diào)節(jié)序列亦呈明顯的高甲基化(P=0.047)。
　　 結(jié)論：自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細(xì)