凋亡細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞IL-12家族細(xì)胞因子調(diào)控的研究.pdf

1、目的:機(jī)體通過吞噬作用清除凋亡細(xì)胞(apoptotic cell，apo)，避免凋亡細(xì)胞的具有潛在細(xì)胞毒性、免疫原性或致炎性的壞死成分暴露在周圍環(huán)境中引發(fā)自身免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，這是機(jī)體一種重要的防御功能。因此快速有效清除體內(nèi)的凋亡細(xì)胞對(duì)人體正常生長(zhǎng)發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用，凋亡細(xì)胞主要由專職吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、未成熟的樹突狀細(xì)胞等吞噬清除，部分被非專職吞噬細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等吞噬。機(jī)體控制炎癥不單單是通過快速有效

2、的清除凋亡細(xì)胞，還包括調(diào)控炎癥性細(xì)胞因子產(chǎn)生。近年來又有很多實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化與很多疾病相關(guān)，比如，白細(xì)胞介素-23(IL-23)高表達(dá)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病等自身免疫病和腫瘤等疾病相關(guān)，IL-12又對(duì)黑色素瘤、腸腺癌、肝癌[7]等腫瘤有抑癌作用。還有大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞被巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞吞噬過程中會(huì)調(diào)控其細(xì)胞因子表達(dá)水平，比如正向調(diào)節(jié)IL-10和負(fù)向調(diào)節(jié)IL-12等。
　　IL-12家族中IL-12和

3、IL-23不僅結(jié)構(gòu)上都是由兩個(gè)亞基(IL-12p35、IL-12p40和IL-23p19、IL-23p40)組成的異源二聚體結(jié)構(gòu)，有共同的亞基p40，而且它們都可由激活的抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生。對(duì)于IL-12和IL-23與疾病的相關(guān)性已經(jīng)有很多實(shí)驗(yàn)報(bào)道，對(duì)于其作用機(jī)制也有了很多了解，本實(shí)驗(yàn)由此著手，研究凋亡細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞受刺激表達(dá)IL-12家族細(xì)胞因子的調(diào)控方向和調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)研究IL-23細(xì)胞因子，為明確相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞因子臨床應(yīng)用

4、奠定分子學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1 Jurkat細(xì)胞（人外周白血病T細(xì)胞）的復(fù)蘇、培養(yǎng)及凋亡細(xì)胞的制備，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　2小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取、培養(yǎng)。
　　3 RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別用空白、凋亡細(xì)胞(apotosis cell)、脂多糖(LPS)和凋亡細(xì)胞+LPS刺激。實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)各組mIL-12p35、mIL-12p40、mIL-2

5、3p19水平。
　　4、用ELISA方法檢測(cè)各組活化RAW細(xì)胞培養(yǎng)液IL-10、前列腺素2(PGE2)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的量。
　　5、針對(duì)IL-23p19 RNA設(shè)計(jì)隨機(jī)引物，對(duì)各組刺激后RAW細(xì)胞做Real-time PCR檢測(cè)IL-23p19轉(zhuǎn)錄前水平。
　　6、用含IL-23p19基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后裂解檢測(cè)各組熒光素蛋白強(qiáng)度。
　　7、對(duì)RAW細(xì)胞分別用凋亡細(xì)胞、

6、凋亡細(xì)胞+LPS刺激，刺激后加入轉(zhuǎn)錄抑制劑dichlorobenzimidazole(DRB)+放線菌素D(ACD)，阻止新的RNA產(chǎn)生，檢測(cè)兩組各時(shí)間點(diǎn)p19mRNA衰變情況。
　　8用Western Blot（免疫印跡實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)被刺激RAW細(xì)胞中總p38和磷酸化p38的含量。
　　9、用不同濃度的MAPK p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑SB203580作用RAW細(xì)胞后用LPS刺激，Real-time PCR檢測(cè)各組p19mRN

7、A水平。
　　10、設(shè)計(jì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞使其高表達(dá)p38，再分別用空白、apo、LPS刺激細(xì)胞，通過Real-time PCR檢測(cè)各組p19mRNA水平。
　　11、將apo+LPS刺激后的RAW細(xì)胞分兩組，其中一組加入SB203580，Real-time PCR檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)兩組p19mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1、用星形孢菌素(staurosporine)處理Jurket細(xì)胞成功制備凋亡細(xì)胞，提

8、供后續(xù)研究的刺激條件。
　　2、凋亡細(xì)胞(apo)+LPS作用于腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19mRNA量較單獨(dú)用LPS刺激減低。凋亡細(xì)胞(apo)+LPS作用于RAW巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19mRNA量較單獨(dú)用LPS刺激減低。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所以凋亡細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)的IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19mRNA均有抑制作

9、用。
　　3、用ELISA方法檢測(cè)各組活化后RAW264.7細(xì)胞株和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-10、PGE2、TGF-β的量，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞對(duì)IL-10、PGE2的分泌無影響，但是促進(jìn)TGF-β的分泌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、利用real-time PCR檢測(cè)分別用空白對(duì)照、凋亡細(xì)胞(apo)、LPS和凋亡細(xì)胞（apo）+LPS刺激的RAW細(xì)胞的mIL-23p19水平，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞并沒有在轉(zhuǎn)錄水平上抑制IL-23p19的

10、表達(dá)，所以凋亡細(xì)胞對(duì) mIL-23p19的抑制作用不是在轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)的。
　　5、用含有mIL-23p19啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW細(xì)胞后，培養(yǎng)裂解細(xì)胞檢測(cè)熒光素蛋白含量，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞(apo)+LPS刺激的RAW細(xì)胞的熒光素蛋白最高，說明凋亡細(xì)胞不會(huì)抑制IL-23p19的啟動(dòng)子的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證凋亡細(xì)胞對(duì)mIL-23p19的抑制作用不是在轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)的。
　　6、激活的RAW細(xì)胞加入轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D和dichloroben

11、zimidazole(DRB)檢測(cè)IL-23p19mRNA剩余量，發(fā)現(xiàn)單單LPS刺激RAW細(xì)胞產(chǎn)生IL-23p19mRNA的衰變速度慢于凋亡細(xì)胞(apo)+LPS共同刺激時(shí)。說明凋亡細(xì)胞抑制IL-23p19表達(dá)可能是通過促進(jìn)IL-23p19mRNA衰變實(shí)現(xiàn)的，凋亡細(xì)胞的抑制作用是在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)的。
　　7、通過Western Blot發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞（apo）+LPS刺激后的RAW細(xì)胞的磷酸化的p38含量明顯少于LPS刺激后的RAW

12、細(xì)胞，說明凋亡細(xì)胞抑制了p38的磷酸化，進(jìn)而抑制了MAPK p38信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　8、RAW細(xì)胞加入不同濃度的MAPK p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑SB203580，再用LPS刺激，發(fā)現(xiàn)IL-23p19mRNA水平與SB203580濃度呈反比，說明MAPKp38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-23p19很重要。
　　9、與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的RAW細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后高表達(dá)p38的RAW細(xì)胞在被LPS刺激后IL-23p19mRNA水平

13、明顯增高，進(jìn)一步說明MAPKp38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-23p19很重要。
　　10、用apo+LPS活化的RAW細(xì)胞加入SB203580組較未加組的p19mRNA衰變的快。
　　結(jié)論
　　1、凋亡細(xì)胞抑制活化巨噬細(xì)胞IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19mRNA的表達(dá)。
　　2、凋亡細(xì)胞對(duì)IL-10和PGE2分泌無影響，但促進(jìn)TGF-β的分泌。
　　3、凋亡細(xì)胞對(duì)mIL-23p19