CCL20基因敲低型人角質(zhì)形成細(xì)胞克隆篩選及其長期體外效應(yīng)研究.pdf

1、大面積燒傷及其他皮膚損傷患者因自體皮膚來源受限常需大量異體皮膚覆蓋創(chuàng)面。盡管異基因組織工程皮膚產(chǎn)品已初步應(yīng)用于臨床，但仍無法避免機(jī)體對其的排斥反應(yīng)?？朔@類免疫排斥反應(yīng)的關(guān)鍵技術(shù)之一就是要對種子細(xì)胞引起排斥反應(yīng)的重要靶基因進(jìn)行修飾。趨化因子CCL20通過趨化皮膚移植受者的郎格漢斯細(xì)胞在異基因組織工程皮膚移植物的排斥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系( HaCaT)不僅具有與表皮干細(xì)胞相似的表型、增殖和分化特性，而且其遺傳特性穩(wěn)

2、定、不具有成瘤性，可作為組織工程皮膚種子細(xì)胞的理想候選者。若能對HaCaT的CCL20基因進(jìn)行長期穩(wěn)定的下調(diào)修飾，則可能達(dá)到改良組織工程皮膚種子細(xì)胞的目的。在已經(jīng)構(gòu)建成功人CCL20基因特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)重組慢病毒表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，本研究將利用這些載體感染HaCaT，篩選出陽性細(xì)胞克隆，并在mRNA水平、蛋白水平及其對朗格漢斯細(xì)胞的趨化效應(yīng)來檢測其對CCL20基因的干擾效果和體外效應(yīng)，預(yù)期獲得CCL20基因敲低型人角質(zhì)形成

3、細(xì)胞克隆，為制備低免疫排斥反應(yīng)的新型組織工程皮膚提供種子細(xì)胞。 目的: 1.探索不同基因轉(zhuǎn)移方法將不同大小質(zhì)粒導(dǎo)入人角質(zhì)形成細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率，為尋找人角質(zhì)形成細(xì)胞的高效基因?qū)敕椒ㄌ峁?shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.基于前一部分的研究結(jié)果，采用慢病毒載體攜帶CCL20-shRNA對HaCaT進(jìn)行基因修飾，經(jīng)G418篩選出CCL20基因特異型HaCaT克隆和CCL20基因錯配型HaCaT克隆，并在CCL20 mRNA水平上初步鑒

4、定其干擾效果。 3.在mRNA和蛋白水平上進(jìn)一步觀察長期穩(wěn)定傳代的HaCaT克隆的CCL20干擾效應(yīng)。 4.采用人臍血CD34+細(xì)胞，經(jīng)不同細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)方案，觀察朗格漢斯細(xì)胞(CDla+細(xì)胞)的產(chǎn)量，并作為LC趨化模型的效應(yīng)細(xì)胞，觀察HaCaT克隆對LC的趨化效應(yīng)。 方法: 1.分別采用脂質(zhì)體和陽離子多聚物法將四種不同大小的質(zhì)粒( pEGFP-N2、pSUPER-EGFP、pHSER-GFP和plox

5、P-EGFP)轉(zhuǎn)染HaCaT、HeLa和293FT，以熒光倒置顯微鏡計(jì)數(shù)綠色熒光陽性的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。 2.采用電穿孔法結(jié)合細(xì)胞系電轉(zhuǎn)試劑將四種不同大小的質(zhì)粒( pEGFP-N2、pSUPER-EGFP、pHSER-GFP和ploxP-EGFP)轉(zhuǎn)染HaCaT、以熒光倒置顯微鏡計(jì)數(shù)綠色熒光陽性的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。 3.采用CaCl2法在293FT包裝重組慢病毒載體pHSER-CCL20-shRNA-GFP-SIN的慢病毒顆粒，以流

6、式細(xì)胞術(shù)檢測病毒滴度，并將滴度確定的慢病毒轉(zhuǎn)染HaCaT。 4.采用不同濃度的G418培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT，篩選具有細(xì)胞毒性的G418最低濃度，將慢病毒成功感染的HaCaT用有限稀釋法加樣至96孔板，并結(jié)合細(xì)胞毒性最低濃度的G418進(jìn)行壓力篩選5-8周。 5.建立體外炎性細(xì)胞因子刺激HaCaT產(chǎn)生CCL20的模型：將HaCaT接種于6孔板中，48h后更換含濃度均為100ng/ml的TNF-α和IL-1β的DK培養(yǎng)基，培養(yǎng)

7、24h后的細(xì)胞采用Trizol法提取總RNA，培養(yǎng)48h后的細(xì)胞上清被保存于-20℃?zhèn)溆谩?6.熒光定量PCR技術(shù)(qPCR):以GAPDH為內(nèi)標(biāo)，檢測細(xì)胞CCL20 mRNA相對表達(dá)量。比較CCL20基因特異型HaCaT克隆和對照組HaCaT細(xì)胞CCL20 mRNA相對表達(dá)量，觀察CCL20基因特異型克隆對CCL20的下調(diào)。 7.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)：在酶標(biāo)儀上檢測CCL20標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的OD450值。根據(jù)試

8、劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD450值，求出其擬合曲線和方程；將樣品OD450值代入方程，得到樣品中CCL20的蛋白濃度。比較CCL20基因特異型細(xì)胞克隆和對照組HaCaT細(xì)胞分泌CCL20的濃度，觀察CCL20基因特異型細(xì)胞克隆CCL20的下調(diào)。 8.先用人淋巴細(xì)胞分離液得到臍血單個(gè)核細(xì)胞，以CD34直接免疫磁珠法對臍血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行直接標(biāo)記，分選和純化臍血單個(gè)核細(xì)胞中的CD34+細(xì)胞。 9.以5種不同的細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)方案

9、，對分選出的CD34+細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察其生長形態(tài)變化、集落的形成，并對誘導(dǎo)培養(yǎng)第6d和第12d的CD34+細(xì)胞進(jìn)行CDlα、HLA-DR等LC表型分子，以及CD40、CD80等共刺激分子表型的檢測。篩選出最佳的LC體外誘導(dǎo)方案。 10.以最佳誘導(dǎo)方案體外培養(yǎng)誘導(dǎo)得到的LC，建立體外LC的趨化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停阂訡CL20標(biāo)準(zhǔn)品檢測對LC的趨化效應(yīng)，以驗(yàn)證趨化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定性。以不同基因修飾狀態(tài)的HaCaT為對象，觀察HaCaT

10、克隆在TNF-α和IL-1β共刺激48h的細(xì)胞上清中產(chǎn)生的CCL20因子對LC的趨化效應(yīng)。 結(jié)果: 1.G418壓力篩選野生型HaCaT的最低細(xì)胞毒性濃度為400μg/ml。 2.將pEGFP-N2、pSUPER-EGFP、pHSER-GFP和ploxP-EGFP四種質(zhì)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、陽離子多聚物和電穿孔法聯(lián)合細(xì)胞核轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HaCaT的轉(zhuǎn)染率分別為1.0～3.3％、1.0~3.7％和3.3％～22.3％；

11、采用脂質(zhì)體和陽離子多聚物轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HeLa的轉(zhuǎn)染率分別為30.3％～35.7％和33.7％～36.7％；采用脂質(zhì)體和陽離子多聚物轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293FT的轉(zhuǎn)染率分別為80.0％～84.7％和81.3％～86.7％。將pHSER-GFP包裝成慢病毒轉(zhuǎn)染HaCaT的轉(zhuǎn)染率為97％。 3.CCL20-shRNA慢病毒載體經(jīng)包裝后感染HaCaT，轉(zhuǎn)染率可達(dá)90％以上，經(jīng)G418壓力篩選5～8周后共獲得了38株克隆，其中HaCaT-CCL20

12、-shRNAl有12株克隆，HaCaT- CCL20-shRNA2有16株克隆，HaCaT- CCL20-shRNA3有10株克隆。熒光定量PCR初步檢測已傳代10～15代的28株克隆CCL20 mRNA相對量，以HaCaT為對照計(jì)算出抑制率：70％-100％的有9株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNA1克隆有4株，HaCaT- CCL20-shRNA2克隆有4株，HaCaT- CCL20-shRNA3克隆有1株)；50％-70

13、％的有4株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNA1克隆有1株，HaCaT-CCL20-shRNA2克隆有3株)；0-50％的有9株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNAl克隆有3株，HaCaT- CCL20-shRNA2克隆有3株，HaCaT- CCL20-shRNA3克隆有3株。)；-293％～0％的有6株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNAl克隆有1株，HaCaT-CCL20-shRNA2克隆有2株，HaCaT-

14、 CCL20-shRNA3克隆有3株。)。 4.采用熒光定量PCR和ELISA進(jìn)一步分析結(jié)果3中CCL20mRNA抑制率>50％的已傳35～45代的11株克隆， CCL20mRNA表達(dá)抑制率高達(dá)75％以上且其蛋白表達(dá)抑制率也高達(dá)85％以上的CCL20基因特異型有4株。 5.流式細(xì)胞術(shù)分析5種細(xì)胞因子方案體外誘導(dǎo)培養(yǎng)LC的結(jié)果顯示，方案IV、V誘導(dǎo)培養(yǎng)6天和12天的CDla+細(xì)胞百分率和CDla+細(xì)胞數(shù)量均明顯多于方案I、

15、II和III；方案V誘導(dǎo)培養(yǎng)6天的CD80+和CD40+細(xì)胞百分率明顯高于方案IV；方案IV誘導(dǎo)培養(yǎng)12天的HLA-DR+細(xì)胞百分率顯著高于方案V。 6.按照方案IV進(jìn)行體外培養(yǎng)誘導(dǎo)LC，并用于體外趨化實(shí)驗(yàn)，初步結(jié)果顯示，相對于未修飾的HaCaT，炎性細(xì)胞因子刺激的CCL20基因敲低型克隆對LC趨化效應(yīng)均受抑制。 結(jié)論: 1.常用的化學(xué)轉(zhuǎn)染法較難將外源性基因?qū)肴私琴|(zhì)形成細(xì)胞，慢病毒法的轉(zhuǎn)染率明顯優(yōu)于聯(lián)合細(xì)胞核轉(zhuǎn)

16、染試劑的電穿孔法，而且質(zhì)粒大小不同對導(dǎo)入的效率也有明顯的影響。 2.采用CCL20基因特異型重組慢病毒可高效率地轉(zhuǎn)染人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞( HaCaT)，經(jīng)G418篩選后可獲得CCL20基因特異型細(xì)胞克隆。 3.經(jīng)熒光定量PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)可以篩選出具有長期穩(wěn)定表達(dá)RNA干擾效應(yīng)的CCL20基因特異型HaCaT細(xì)胞克隆. 4.利用細(xì)胞因子組合方案IV體外誘導(dǎo)磁珠分選的CD34+細(xì)胞，可以獲得高表達(dá)CDla+和