慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人角質(zhì)形成細(xì)胞克隆的整合位點(diǎn)傾向性分析及其體外生長特性研究.pdf

1、慢病毒載體穩(wěn)定整合到宿主基因組上,原病毒與宿主之間相互作用,極有可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達(dá)沉默及插入性誘變。慢病毒載體在宿主全基因組范圍內(nèi)的整合位點(diǎn)傾向性分析,已經(jīng)成為監(jiān)測該類載體與宿主相互作用、評價其在臨床前模型和臨床基因治療中應(yīng)用安全性的重要手段。本實(shí)驗(yàn)室前期研究得到四株慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人角質(zhì)形成細(xì)胞克隆(分別命名為1、2、3、4號克隆),若能明確其中的整合位點(diǎn)分布規(guī)律,則可豐富慢病毒載體在表皮細(xì)胞的基因組中整合位點(diǎn)傾向性的認(rèn)識。此外,

2、如果慢病毒載體直接整合入或間接影響到控制宿主細(xì)胞生長、發(fā)育、分化的基因,則有可能改變宿主細(xì)胞生長特性或者出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化。因此,也有必要觀察前述四株克隆細(xì)胞的體外生長特性。本研究將采用連接介導(dǎo)PCR(LM-PCR)技術(shù)分別克隆這四株克隆細(xì)胞中的慢病毒載體整合位點(diǎn)并分析其傾向性,同時檢測這四株克隆細(xì)胞的生長曲線、細(xì)胞周期和凋亡率變化,為慢病毒載體在角質(zhì)形成細(xì)胞基因修飾及皮膚病或皮膚損傷基因治療中應(yīng)用的生物安全性評價提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目

3、的
　　1.檢測慢病毒載體在四株克隆細(xì)胞中的整合位點(diǎn),分別分析其分布規(guī)律。
　　2.分別觀察四株克隆細(xì)胞及HaCaT的生長曲線、細(xì)胞周期和凋亡率,探尋四株克隆細(xì)胞體外生長特性變化。
　　方法
　　1.抽提克隆細(xì)胞基因組DNA,利用MseI和PstI對其雙酶切片段化;
　　2.合成MseI連接子序列并退火成雙鏈,將其連接至片段化后DNA上;
　　3.設(shè)計(jì)并合成針對MseI連接子序列和慢病毒載體(pHSE

4、R-dsRNA-GFP-SIN)末端LTR區(qū)的兩對特異性內(nèi)、外引物,以連接后的DNA作為模板,進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增;
　　4.將第二輪PCR產(chǎn)物連接至pCR4-TOPO載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)TOP10感受態(tài)細(xì)胞,卡那霉素抗性篩選陽性菌落,擴(kuò)增后送測序公司提取質(zhì)粒、Sanger法測序克隆片段;
　　5.去除克隆片段兩端的相關(guān)載體序列和連接子序列,將所得的DNA序列經(jīng)在線工具GTSG-

5、QuickMap(http://www.gtsg.org/quickmap.jsp)進(jìn)行人類染色體基因組上的定位后得到整合位點(diǎn),再以GTSG-QuickMap自動模擬的1000000個隨機(jī)整合位點(diǎn)作為對照,比較兩組在染色體、基因及其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、CpG島、重復(fù)元件、癌基因及其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域的整合頻率(整合位點(diǎn)百分?jǐn)?shù))差異,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)行卡方檢驗(yàn);
　　6.采用CCK-8(CellCountingKit-8)法、PI染色法、APCAn

6、nexinV/PI雙染法分別檢測克隆細(xì)胞及HaCaT的生長曲線、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)行t檢驗(yàn)、Levene’s方差齊性檢驗(yàn)、t’檢驗(yàn)。
　　結(jié)果
　　1.四株克隆內(nèi)的整合頻率與隨機(jī)對照的比較
　　1號克隆:檢測了2522個陽性轉(zhuǎn)化子,獲得70個整合位點(diǎn);第1、18、20號染色體上、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)50kb范圍(包括上游及下游,即±50kb)、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游50kb范圍(即+50kb)、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上

7、游5kb至50kb范圍(即+5kb~+50kb)、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5kb范圍(即+5kb)、CpG島附近5至50kb范圍(包括上、下游)內(nèi)的整合頻率顯著高于對照組[15.714％v.s.7.904%,(P=0.028);7.143%v.s.2.593%,(P=0.043);7.143%v.s.2.083%,(P=0.011);95.71%v.s.69.82%,(P=0.000);45.71%v.s.25.22%,(P=0.000);

8、31.43%v.s.19.03%,(P=0.013);14.29%v.s.6.18%,(P=0.010);45.71%v.s.33.53%,(P=0.031],RNA重復(fù)序列(RNArepeats)及未知重復(fù)元件內(nèi)的整合頻率顯著低于對照組[0.00%v.s.0.04%,(P=0.004);0.00%v.s.0.06%,(P=0.025)],基因(包括外顯子、內(nèi)含子)、癌基因及其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近5kb、5kb至50kb、50kb至250k

9、b區(qū)域(包括上、下游)內(nèi)的整合頻率與對照組并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
　　2號克隆:檢測了1458個陽性轉(zhuǎn)化子,獲得282個整合位點(diǎn);第20號染色體上、基因、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5kb范圍(包括上游及下游,即±5kb)、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)50kb范圍(包括上游及下游,即±50kb)、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游50kb范圍(即+50kb)、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游50kb范圍(即-50kb)、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5kb至50kb范圍(即+5kb~+50kb)

10、、CpG島附近5kb范圍(包括上、下游)、5kb至50kb范圍(包括上、下游)內(nèi)的整合頻率顯著高于對照組[6.028%v.s.2.083%,(P=0.000);51.06%v.s.44.61%,(P=0.034);14.18%v.s.10.43%,(P=0.039);91.84%v.s.69.82%,(P=0.000);40.78%v.s.25.22%,(P=0.000);51.06%v.s.44.61%,(P=0.034);32.62

11、%v.s.19.03%,(P=0.000);14.54%v.s.7.18%,(P=0.000);42.55%v.s.33.53%,(P=0.002)],第2、13號染色體上、CpG島50kb至250kb范圍(包括上、下游)、長散布核元件(LINE)、癌基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近50kb至250kb區(qū)域(包括上、下游)內(nèi)整合頻率顯著低于對照組[4.610%v.s.8.374%,(P=0.030);1.064%v.s.3.329%,(P=0.03

12、4);30.14%v.s.37.24%,(P=0.016);12.77%v.s.22.08%,(P=0.000);0.10%v.s.5.98%,(P=0.003)],內(nèi)含子、外顯子內(nèi)的整合頻率的整合頻率與對照組并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
　　3號克隆:檢測了1827個陽性轉(zhuǎn)化子,獲得323個整合位點(diǎn);第16、20號染色體上、基因、內(nèi)含子、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游50kb范圍(即-50kb,該范圍即為基因內(nèi))、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游5kb至50kb

13、范圍(即-5kb~-50kb)、CpG島附近5kb范圍(包括上、下游)內(nèi)的整合頻率顯著高于對照組[5.573%v.s.2.747%,(P=0.003);4.025%v.s.2.083%,(P=0.025);50.15%v.s.44.61%,(P=0.045);47.99%v.s.42.12%,(P=0.038);50.15%v.s.44.61%,(P=0.045);45.82%v.s.40.37%,(P=0.046);11.15%v.s

14、.7.18%,(P=0.008)],第4、5號染色體及X染色體上、LINE及人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列(LTRs,HERV)內(nèi)的整合頻率顯著低于對照組[3.406%v.s.6.565%,(P=0.029);3.406%v.s.6.188%,(P=0.038);2.477%v.s.5.252%,(P=0.035);12.69%v.s.22.08%,(P=0.000);5.57%v.s.9.11%,(P=0.035)],癌基因及其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附

15、近5kb、5kb至50kb、50kb至250kb區(qū)域(包括上、下游)內(nèi)的整合頻率與對照組并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
　　4號克隆:檢測了1210個陽性轉(zhuǎn)化子,獲得199個整合位點(diǎn);第15、16號染色體上、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)50kb范圍(包括上游及下游,即±50kb)、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游50kb范圍(即+50kb)、基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5kb至50kb范圍(即+5kb~+50kb)、CpG島附近5至50kb范圍(包括上、下游)、短散布核元件(

16、SINE)內(nèi)的整合頻率顯著高于對照組[5.528%v.s.2.865%,(P=0.024);6.030%v.s.2.747%,(P=0.005);83.42%v.s.69.82%,(P=0.000);36.18%v.s.25.22%,(P=0.000);28.14%v.s.19.03%,(P=0.001);46.23%v.s.33.53%,(P=0.000);21.10%v.s.13.66%,(P=0.002)],第4、5號染色體上、L

17、INE內(nèi)的整合頻率顯著低于對照組[2.513%v.s.6.565%,(P=0.021);2.513%v.s.6.188%,(P=0.031);10.05%v.s.22.08%,(P=0.000)],基因(包括外顯子、內(nèi)含子)、癌基因及其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近5kb、5kb至50kb、50kb至250kb區(qū)域(包括上、下游)內(nèi)的整合頻率與對照組并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.整合位點(diǎn)在四株克隆癌基因及非癌基因內(nèi)的分布
　　1號克隆中共有整

18、合位點(diǎn)70個,35個在克隆基因組中的非癌基因內(nèi),其中32個在內(nèi)含子內(nèi),3個在外顯子內(nèi),0個在克隆基因組中的癌基因內(nèi)。2號克隆中共有整合位點(diǎn)282個,139個在克隆基因組中的非癌基因內(nèi),其中128個在內(nèi)含子內(nèi),11個在外顯子內(nèi),5個在克隆基因組中的癌基因內(nèi),其中4個在內(nèi)含子內(nèi),1個在外顯子內(nèi)。3號克隆中共有整合位點(diǎn)323個,156個在克隆基因組中的非癌基因內(nèi),其中150個在內(nèi)含子內(nèi),6個在外顯子內(nèi),6個在克隆基因組中的癌基因內(nèi),其中5個在

19、內(nèi)含子內(nèi),1個在外顯子內(nèi)。4號克隆中共有整合位點(diǎn)199個,92個在克隆基因組中的非癌基因內(nèi),其中88個在內(nèi)含子內(nèi),4個在外顯子內(nèi),2個在克隆基因組中的癌基因內(nèi),其中均在內(nèi)含子內(nèi)。
　　3.四株克隆體外生長情況的變化
　　與HaCaT比較,1號克隆在培養(yǎng)后第2、3天和第7~10天的光密度值均顯著升高[(0.562±0.001)%v.s.(0.545±0.006)%,(P=0.009);(1.362±0.003)%v.s.(1.

20、348±0.002)%,(P=0.003);(4.290±0.003)%v.s.(4.034±0.011)%,(4.679±0.005)%v.s.(4.214±0.003)%,(4.820±0.002)%v.s.(4.252±0.003)%,(4.801±0.002)%v.s.(4.063±0.001)%,(P均為0.000)],而在第4~6天的光密度值均顯著降低[(2.267±0.002)%v.s.(2.456±0.005)%,(2.

21、968±0.009)%v.s.(3.272±0.002)%,(3.282±0.006)%v.s.(3.862±0.005)%,(P均為0.000)];2號克隆在培養(yǎng)后第8、9天的光密度值均顯著降低[(4.174±0.003)%v.s.(4.214±0.003)%,(4.193±0.001)%v.s.(4.252±0.003)%,(P均為0.000)],而在第10天的光密度值顯著升高[(4.801±0.002)%v.s.(4.063±0.

22、001)%,(P=0.000)],其余各時相點(diǎn)均無明顯變化;3號克隆在培養(yǎng)后第1~10天的光密度值均顯著降低[(0.191±0.001)%v.s.(0.200±0.001)%,(0.473±0.001)%v.s.(0.545±0.006)%,(1.262±0.003)%v.s.(1.348±0.002)%,(2.274±0.007)%v.s.(2.456±0.005)%,(2.801±0.005)%v.s.(3.272±0.002)%,

23、(3.280±0.003)%v.s.(3.862±0.005)%,(3.660±0.005)%v.s.(4.034±0.011)%,(3.810±0.006)%v.s.(4.214±0.003)%,(3.367±0.004)%v.s.(4.252±0.003)%,(3.272±0.004)%v.s.(4.063±0.001)%,(P均為0.000)];4號克隆在培養(yǎng)后第2~6天及第9~10天的光密度值均顯著降低[(0.499±0.003

24、)%v.s.(0.545±0.006)%,(P=0.000);(1.300±0.002)%v.s.(1.348±0.002)%,(P=0.000);(2.374±0.015)%v.s.(2.456±0.005)%,(P=0.001);(2.892±0.018)%v.s.(3.272±0.002)%,(P=0.000);(3.481±0.009)%v.s.(3.862±0.005)%,(P=0.000)],而在第7天的光密度值顯著升高[(

25、4.077±0.007)%v.s.(4.034±0.011)%,(P=0.005)]。
　　4.四株克隆細(xì)胞周期的改變
　　與HaCaT比較,1、2、4號克隆處于G0+G1期細(xì)胞的百分率顯著降低[(35.32±1.23)%v.s.(45.24±1.88)%,(P=0.002);(41.16±1.64)%v.s.(45.24±1.88)%,(P=0.047);(39.86±1.20)%v.s.(45.24±1.88)%,(P=