腺病毒與慢病毒載體轉(zhuǎn)染離體兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的對(duì)比研究.pdf

1、目的：利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為報(bào)告基因,觀察比較腺病毒與慢病毒載體分別介導(dǎo)EGFP對(duì)體外培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及對(duì)細(xì)胞的安全性,探討較優(yōu)一種病毒載體作為角膜基因治療載體的可行性,為后繼采用該病毒載體介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)染治療屈光術(shù)后角膜haze生成奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：離體兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的原代、傳代培養(yǎng)及鑒定；實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組,轉(zhuǎn)染組用慢病毒載體攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因(LV-EGFP)與腺病毒載體攜

2、帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(AV-EGFP)分別感染離體兔角膜基質(zhì)細(xì)胞(RCSCs),對(duì)照組則加入空白培養(yǎng)液,在不同感染復(fù)數(shù)(MOI)及感染后不同的時(shí)間段在倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)情況,流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組EGFP的mRNA表達(dá)情況；光鏡及電鏡技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化；MTT比色法檢測(cè)兩種病毒載體對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞活性的影響。
　　 結(jié)果：⑴AV-EGFP感染基質(zhì)細(xì)

3、胞后從24-48小時(shí)開(kāi)始就可見(jiàn)明顯的綠色熒光,起始時(shí)間早于LV-EGFP轉(zhuǎn)染組。隨著MOI值增大,兩轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率均增高。轉(zhuǎn)染后第3天,慢病毒轉(zhuǎn)染組在MOI=1000時(shí)轉(zhuǎn)染效率可達(dá)61％,而腺病毒轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率為40％。在同一MOI值下,慢病毒較腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑵RT-PCR檢測(cè)兩轉(zhuǎn)染組均有.EGFP的mRNA表達(dá),而對(duì)照組無(wú)表達(dá)。AV-EGFP與LV-EGFP轉(zhuǎn)染組相比,AV-EGFP轉(zhuǎn)染組的

4、EGFP mRNA表達(dá)偏低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑶電鏡結(jié)果顯示AV-EGFP轉(zhuǎn)染組在MOI=104時(shí)及LV-EGFP轉(zhuǎn)染組在MOI=1000時(shí)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,而慢病毒在MOI=500時(shí),轉(zhuǎn)染組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常。⑷慢病毒載體在MOI≤500時(shí),腺病毒載體在MOI≤1000時(shí),兩種病毒對(duì)細(xì)胞活性的影響,轉(zhuǎn)染組分別與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慢病毒載體在MOI≥1000,腺病毒載體在MOI≥104轉(zhuǎn)染組與對(duì)照

5、組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),病毒載體抑制細(xì)胞的活性,細(xì)胞存活率下降。且當(dāng)MOI=104時(shí),慢病毒載體轉(zhuǎn)染組與腺病毒載體轉(zhuǎn)染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),兩病毒載體對(duì)細(xì)胞活性影響無(wú)差別,均導(dǎo)致細(xì)胞活性下降。
　　 結(jié)論：①腺病毒與慢病毒載體均可有效轉(zhuǎn)染離體兔角膜基質(zhì)細(xì)胞,以慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率更高。②腺病毒最適感染復(fù)數(shù)為1000,其轉(zhuǎn)染效率在第三天可達(dá)40％,慢病毒最適感染復(fù)數(shù)為500,其轉(zhuǎn)染效率在第三天可達(dá)