RyR2-shRNA重組慢病毒載體對離體心肌細(xì)胞RyR2表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：
　　 RyR2是存在于哺乳動物心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum,SR)上的一類細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放通道,屬于RyRs受體家族。通過RyR2通道瞬間釋放出大量的鈣離子是心肌興奮-收縮偶聯(lián)的一個重要過程,其作用的主要機(jī)制稱為鈣誘導(dǎo)的鈣釋放(Ca2+ induced Ca2+ release,CICR)。心臟的正常功能是通過心肌細(xì)胞有規(guī)律地收縮和舒張來實現(xiàn)的,而心肌細(xì)胞的收縮與細(xì)胞內(nèi)的Ca2+密不可

2、分。RyR2的激活可使細(xì)胞內(nèi)鈣離子迅速增加,其細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度可快速增高10倍以上,從而為心肌細(xì)胞的收縮提供足夠的Ca2+。因而,各種原因造成的RyR2基因突變、表達(dá)異?；蚬δ墚惓Ｒ鸬腃a2+滲漏是心力衰竭和致死性心律失常的發(fā)病基礎(chǔ)。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種在自然界中廣泛存在的進(jìn)化中相當(dāng)保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)是通過導(dǎo)入外源dsRNA在體內(nèi)加工成RNA干擾效應(yīng)分子

3、,從而實現(xiàn)同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象。目前應(yīng)用的介導(dǎo)siRNA傳遞的載體有很多,而慢病毒載體相比其他載體而言,其介導(dǎo)的RNAi可將外源序列穩(wěn)定地導(dǎo)入分裂相和非分裂相的細(xì)胞中,并能夠高效、特異、持久地抑制同源基因的表達(dá)。因此,被廣泛地采用為在哺乳動物離體培養(yǎng)細(xì)胞中實現(xiàn)特異性基因沉默的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具。
　　 目的：
　　 構(gòu)建RyR2-shRNA的重組慢病毒表達(dá)載體,觀察其對離體培養(yǎng)的小鼠心肌中RyR2表達(dá)的影響,建立有效抑

4、制RyR2基因表達(dá)的RNA干擾方法。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)siRNA設(shè)計原則,針對小鼠RyR2基因位點(diǎn)設(shè)計4段19nt shRNA片段,并依據(jù)靶序列合成針對19nt shRNA序列的4對59nt編碼的shRNA寡聚核苷酸片段;
　　 2.將上述shRNA寡聚核苷酸片段的正義鏈和反義鏈退火后,在T4 DNA連接酶作用下與經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后與慢病毒載體psiHIV-U6-EGFP連接,形成表達(dá)R

5、yR2-shRNA的重組慢病毒載體;
　　 3.將重組慢病毒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體細(xì)胞DH5α,挑選陽性菌落,提取質(zhì)粒,經(jīng)測序鑒定構(gòu)建成功的重組慢病毒載體,分別命名為psiHIV-U6-shRNA1,psiHIV-U6-shRNA2,psiHIV-U6-ShRNA3,psiHW-U6-shRNA4;
　　 4.常規(guī)培養(yǎng)293T細(xì)胞,將重組慢病毒質(zhì)粒psiHIV-U6-shRNA1,psiHIV-U6-shRNA2,psiHI

6、V-U6-shRNA3,psiHIV-U6-shRNA4分別與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并行滴度測定,經(jīng)包裝得到重組慢病毒載體顆粒,分別命名為Lenti-siRyR2-1,Lenti-siRyR2-2,Lenti-siRyR2-3,Lenti-siRyR2-4;
　　 5.將重組慢病毒Lenti-siRyR2-1,Lenti-siRyR2-2,Lenti-siRyR2-3,Lenti-siRyR2-4及空病毒載體感染新生小

7、鼠心肌細(xì)胞,72小時后于倒置熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá),經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測各組重組慢病毒載體對心肌細(xì)胞的感染效率;
　　 6.以GAPDH為內(nèi)參基因,Real-time PCR檢測各組細(xì)胞RyR2 mRNA表達(dá)水平;
　　 7.統(tǒng)計學(xué)處理:利用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析比較不同感染組細(xì)胞與對照組細(xì)胞RyR2mRNA表達(dá)的差異,以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。
　　

8、 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)過DNA測序證實靶向小鼠RyR2基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體均構(gòu)建成功;
　　 2.通過將重組慢病毒質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,為后續(xù)試驗獲得了適宜的病毒滴度。通過逐孔稀釋法測得重組慢病毒Lenti-siRyR2-1,Lenti-siRyR2-2,Lenti-siRyR2-3,Lenti-siRyR2-4及Lenti-NC病毒滴度分別為1.1×107IU/mL、1.3×107 IU/m

9、L、1.2×107 IU/mL、1.5×107 IU/mL、1.0×107 IU/mL;
　　 3.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測各重組慢病毒(Lenti-siRyR2-1-4,Lenti/NC)對原代培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞的感染效率分別為82.13％,80.22%,83.40%,89.12%,85.74%;
　　 4.經(jīng)Real-time PCR檢測,與對照組和空載體組相比,各組重組慢病毒載體均使RyR2 mRNA水平顯著降低(P＜0.0