基于慢病毒載體和轉(zhuǎn)錄因子的人角膜基質(zhì)細(xì)胞重編程研究.pdf

1、多能干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)、組織工程和藥物發(fā)現(xiàn)與評價等領(lǐng)域極具應(yīng)用價值,科學(xué)家們曾嘗試通過多種途徑獲取人的多能干細(xì)胞。但是現(xiàn)存方法的廣泛應(yīng)用在技術(shù)、細(xì)胞來源、免疫排斥、倫理、宗教或法律等方面存在諸多限制,而iPS細(xì)胞能夠克服這些問題的限制,被譽為生命科學(xué)領(lǐng)域新的里程碑。隨著人類對干細(xì)胞分化調(diào)控機制認(rèn)識的不斷加深,從人的 iPS細(xì)胞將會衍生出更多種類的人類細(xì)胞, iPS技術(shù)將成為細(xì)胞替代治療、新藥篩選與評價及其它用途(如提供大量的種子細(xì)胞)的基

2、礎(chǔ)。
　　在組織工程人角膜基質(zhì)的工作中,基質(zhì)細(xì)胞是核心內(nèi)容之一。人角膜基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時有良好的增殖能力,而且能夠長期發(fā)揮生物學(xué)功能。因此,獲得數(shù)量足夠、有再生活力的人角膜基質(zhì)種子細(xì)胞是組織工程開展研究的前提和基礎(chǔ)。人角膜基質(zhì)種子細(xì)胞的來源多種,包括異體細(xì)胞和自體細(xì)胞。在臨床應(yīng)用中,異體細(xì)胞容易產(chǎn)生免疫排斥,這極大限制了它的應(yīng)用。自體細(xì)胞獲取也有一定的困難:由于體細(xì)胞的體外增殖有一定限度,無法從很小的角膜基質(zhì)組織中獲得大量的細(xì)胞

3、,而獲取大量角膜基質(zhì)組織又容易對正常角膜的結(jié)構(gòu)和功能造成破壞;其他類型的自體細(xì)胞,如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞或脂肪干細(xì)胞,亦不能完全替代角膜基質(zhì)細(xì)胞的功能,無法成為組織工程角膜基質(zhì)理想的種子細(xì)胞。
　　人胚胎干細(xì)胞在體外有分化成各種細(xì)胞類型的能力,iPS細(xì)胞的發(fā)明讓人們可以從自身體細(xì)胞獲得大量的、無免疫原性的多能干細(xì)胞,因此iPS細(xì)胞來源的角膜基質(zhì)細(xì)胞成為了組織工程人角膜基質(zhì)種子細(xì)胞的非常有希望的候選。但是由于人們在人角膜

4、基質(zhì)細(xì)胞分化的分子機制方面缺少足夠的研究,導(dǎo)致很難在體外定向地將iPS細(xì)胞分化成足夠多的、純凈的角膜基質(zhì)細(xì)胞用于臨床。最近有大量研究證實iPS細(xì)胞帶有來源細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)記憶,iPS細(xì)胞基因組中與來源細(xì)胞有關(guān)聯(lián)的甲基化組也影響了它們的分化傾向,這一發(fā)現(xiàn)啟示我們可以充分利用iPS細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)記憶,來完成那些困難的定向分化。
　　本文中我們首先對人角膜基質(zhì)細(xì)胞進行了原代培養(yǎng)。將去除上皮和內(nèi)皮細(xì)胞層的人角膜基質(zhì)進行機械分割,在培養(yǎng)板

5、上進行貼壁培養(yǎng),后將遷出的角膜基質(zhì)細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞具有樹突狀形狀特征,核型鑒定發(fā)現(xiàn)其染色體具有人類染色體的典型特征,免疫熒光檢測表明體外培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞均為波形蛋白陽性表達,且不含角膜上皮細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞。
　　隨后我們用293T細(xì)胞以及第二代慢病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)制作了分別攜帶Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種外源性基因的慢病毒,感染效率測定發(fā)現(xiàn)當(dāng)病毒數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量之比為10:1時,感染效率超過8

6、0％。我們用四種病毒共同感染角膜基質(zhì)細(xì)胞,感染后將細(xì)胞消化、接種到預(yù)先鋪有Matrigel基質(zhì)膠的培養(yǎng)板上,將培養(yǎng)液換為小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)層條件培養(yǎng)液,開始iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后第三天細(xì)胞開始出現(xiàn)了形態(tài)的改變,產(chǎn)生大量上皮樣及圓形的細(xì)胞,誘導(dǎo)后第七天到第九天,培養(yǎng)板中開始出現(xiàn)人胚胎干細(xì)胞樣的細(xì)胞類型,它們的核質(zhì)比較大,細(xì)胞連接緊密,成克隆樣生長。誘導(dǎo)第二十天,胚胎干細(xì)胞樣的細(xì)胞團已經(jīng)非常明顯,我們進行了多能性干細(xì)胞的功能標(biāo)志之一,堿性

7、磷酸酶染色,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)板中有大量堿性磷酸酶陽性細(xì)胞,初步確定已成功誘導(dǎo)人角膜基質(zhì)細(xì)胞成為iPS細(xì)胞,誘導(dǎo)效率為0.4%-0.8%。
　　綜上所述,本文將人角膜基質(zhì)細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞,賦予角膜基質(zhì)細(xì)胞無限的增殖能力,為獲得大量的種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。我們希望在不久的將來,在此工作的基礎(chǔ)上利用iPS細(xì)胞表觀遺傳學(xué)記憶,使大量擴增的角膜基質(zhì)細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞重新定向分化為角膜基質(zhì)細(xì)胞,滿足組織工程對種子細(xì)胞的需求。另外我們還可以將此 i