基于非病毒納米基因傳遞系統(tǒng)的細(xì)胞重編程研究.pdf

1、2006年，Yamanaka等首次實(shí)現(xiàn)了由轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的體細(xì)胞重編程，命名為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)，自此，細(xì)胞重編程技術(shù)成為生命科學(xué)與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通過病毒等載體介導(dǎo)，在體細(xì)胞內(nèi)異位表達(dá)與細(xì)胞多能性相關(guān)的關(guān)鍵因子（如Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等），可以實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞向多能狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)，最終生成表型和分化潛能均類似于胚胎干細(xì)胞的iPSCs。由于iPSCs來源于患者自身的體細(xì)胞，且具有與胚胎干細(xì)胞相當(dāng)?shù)淖晕腋履芰?/p>

2、向三胚層分化的潛能，將iPSCs作為一種替代胚胎干細(xì)胞的種子細(xì)胞應(yīng)用于臨床，可避免胚胎干細(xì)胞涉及的倫理和法律問題，且iPSCs源于患者自身體細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)病人的個(gè)性化治療。目前，iPSCs的臨床應(yīng)用還面臨許多困難，諸如，傳統(tǒng)的病毒轉(zhuǎn)染方法和癌癥相關(guān)因子（如c-Myc）的應(yīng)用存在安全隱患，而非病毒方法的重編程效率低下，難以滿足臨床對(duì)于iPSCs安全性和數(shù)量的需求等等，因此，研究探索安全、高效的重編程策略具有重要的價(jià)值和意義。本文從基于天然多

3、糖的重編程轉(zhuǎn)錄因子OCT4納米傳遞、重編程因子組合的篩選、基于組織工程三維體系的細(xì)胞重編程三個(gè)方面，研究探索安全、高效的體細(xì)胞重編程新策略。
　　第一章細(xì)胞重編程的研究進(jìn)展
　　對(duì)細(xì)胞重編程的概念及研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述;對(duì)細(xì)胞重編程技術(shù)在人類疾病治療、藥物開發(fā)以及生物發(fā)育等領(lǐng)域的應(yīng)用和意義進(jìn)行了探討;通過大量資料查閱，對(duì)細(xì)胞重編程的方法進(jìn)行了綜述;闡述了細(xì)胞重編程技術(shù)的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用于臨床實(shí)踐所面臨的問題，提出了本論文的立題

4、依據(jù)、設(shè)計(jì)思路與構(gòu)想，為本論文實(shí)驗(yàn)工作的順利進(jìn)行提供了理論依據(jù)。
　　第二章基于天然多糖的重編程轉(zhuǎn)錄因子OCT4納米傳遞研究
　　采用水提醇沉、樹脂純化的工藝提取分離了4種高純度、分子量分布集中的天然多糖（文中分別以字母A、B、C、D表示）;采用三種陽離子化方法，即精胺(Sp)、乙二胺(Ed)和聚乙烯亞胺(PEI)修飾的方法，分別對(duì)所得的每種多糖進(jìn)行陽離子化修飾;選擇與體細(xì)胞重編程密切相關(guān)的胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子OCT4作為模型

5、基因，通過瓊脂糖凝膠電泳篩選出了與質(zhì)粒OCT4的結(jié)合效果最佳的4種陽離子多糖（A-Ed、B-PEI、C-Ed和D-Sp）進(jìn)行后續(xù)基因轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià);透射電鏡觀察、粒徑分析以及Zeta電位測(cè)定結(jié)果表明:陽離子多糖能有效壓縮、包裹大分子質(zhì)粒OCT4，得到形態(tài)規(guī)則、表面帶正電荷的球形或橢球形的納米粒;MTT比色法證明了陽離子多糖/OCT4納米粒具有良好的生物安全性;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR以及活細(xì)胞工作站等技術(shù)分別從目的蛋白表

6、達(dá)水平、RNA轉(zhuǎn)錄水平以及納米粒入胞過程等方面對(duì)陽離子多糖/OCT4納米粒的基因轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從多方面證明了陽離子多糖是一種理想的細(xì)胞重編程載體材料。
　　第三章重編程因子組合的篩選與細(xì)胞重編程研究
　　通過對(duì)OCT4、SOX2和miR302-367這3個(gè)因子進(jìn)行隨機(jī)組合，采用陽離子多糖D-Sp作為基因載體，制備了一系列多糖-基因納米粒;以qRT-PCR考察了細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，并通過堿性磷酸酶染色，統(tǒng)計(jì)陽性克隆數(shù)，篩選出

7、了最佳的因子組合:OCT4、SOX2和miR302-367;選用該組合與陽離子多糖D-Sp制備得到D-Sp/OS-miR納米粒，對(duì)人源體細(xì)胞進(jìn)行重編程研究;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、透射電鏡觀察、粒徑測(cè)定以及電位測(cè)量等一系列檢測(cè)，結(jié)果顯示:D-Sp/OS-miR納米粒在質(zhì)量比為10∶1時(shí)，粒徑最小，且集中分布在70～150 nm的區(qū)間內(nèi)，納米粒呈形態(tài)規(guī)整、分散均勻、表面帶正電荷的球形或橢球形;qRT-PCR、免疫熒光、Western blot以

8、及HE組織染色等方法證明了D-Sp/OS-miR納米粒誘導(dǎo)生成的iPSCs能夠表達(dá)胚胎干細(xì)胞多能性標(biāo)記，并且在體、內(nèi)外均能夠向內(nèi)、中、外三個(gè)胚層進(jìn)行分化。
　　第四章基于組織工程三維體系的細(xì)胞重編程研究
　　首次嘗試在三維體系中細(xì)胞重編程的可能性。采用直接凍干、不添加任何交聯(lián)劑的方法制備了膠原支架，并對(duì)支架進(jìn)行了形態(tài)、孔隙率和吸水率等表征;以陽離子多糖D-Sp、磷酸鈣以及編碼Yamanaka因子的4種質(zhì)粒為原料，采用反相微乳

9、法制備了多糖-磷酸鈣混雜納米粒，通過形態(tài)觀察、粒徑測(cè)定、Zeta電位測(cè)量以及瓊脂糖凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)對(duì)納米粒的性質(zhì)進(jìn)行了表征;將多糖-磷酸鈣混雜納米粒吸附到空白膠原支架內(nèi)表面，得到三維載基因納米粒-膠原支架;掃描電鏡下觀察到三維載基因納米粒-膠原支架內(nèi)部疏松多孔的微觀結(jié)構(gòu)，孔徑適宜、相互連通的支架孔道有效模擬了細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維微環(huán)境;將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于三維載基因納米粒-膠原支架進(jìn)行重編程，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞在支架中形成了邊

10、界清晰、形態(tài)規(guī)整的球形或橢球形的iPSC細(xì)胞球;RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:在三維載基因納米粒-膠原支架中，每一個(gè)重編程轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量都顯著高于二維體系（*，P＜0.05），且持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng);HE染色、免疫組化、免疫熒光、染色體核型分析以及啟動(dòng)子甲基化測(cè)定等實(shí)驗(yàn)從形態(tài)、蛋白水平以及基因水平等多方面證明了iPSCs細(xì)胞球的多能性;在三維支架中誘導(dǎo)生成的細(xì)胞球能夠在二維滋養(yǎng)層細(xì)胞上持續(xù)、穩(wěn)定地傳代至20代以上，并建立穩(wěn)定的細(xì)胞系;體內(nèi)畸胎瘤實(shí)

11、驗(yàn)最終證明:三維載基因納米粒-膠原支架能夠成功誘導(dǎo)iPSCs的生成。
　　本論文成功篩選出基于天然多糖的非病毒納米基因載體，并應(yīng)用于重編程轉(zhuǎn)錄因子OCT4納米傳遞，通過對(duì)納米粒的表征和基因轉(zhuǎn)染效率的考察，證明了陽離子多糖作為重編程基因載體的巨大潛能;以安全性良好的microRNA替代癌癥相關(guān)基因C-MYC和KLF4，形成一個(gè)全新的非致癌三因子組合，OCT4+SOX2+miR302-367，然后以篩選出的陽離子多糖為基因載體，成功誘