癌細(xì)胞靶向非病毒基因載體的合成及其性能研究.pdf

1、目前基因治療主要的發(fā)展障礙之一，就是如何有效地將基因釋放到靶細(xì)胞中長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)，而又較少地產(chǎn)生副作用，即載體的效率、靶向性和安全性的問(wèn)題。陽(yáng)離子高分子基因傳遞系統(tǒng)在過(guò)去十幾年取得明顯進(jìn)展，結(jié)果表明結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的高分子很難幫助DNA穿越體內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)的所有屏障，針對(duì)具體的應(yīng)用目的，設(shè)計(jì)多組分、多功能載體將是未來(lái)幾年高分子基因治療研究的方向。 樹(shù)枝狀納米高分子PMAMM是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的陽(yáng)離子多聚物載體，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但作為非病毒載

2、體仍需要在靶向、功能等方面進(jìn)一步的加以完善，例如引入特異靶向性基團(tuán)和側(cè)鏈功能基團(tuán)等來(lái)修飾多聚物骨架，從而調(diào)整和改善載體的性能，賦予載體靶向傳遞基因的能力。 本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)合成了一種新型的以季戊四醇衍生物為核的聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子，本文以此為基礎(chǔ)，為了改善這個(gè)新型載體的性能，利用對(duì)癌細(xì)胞表面特異靶向的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferdn，Tf)、葉酸(Folic acid，F(xiàn)A)等配體對(duì)其進(jìn)行修飾，構(gòu)建受體介導(dǎo)的新型靶向載體系統(tǒng)，賦予

3、載體對(duì)癌細(xì)胞靶向性基因傳遞的能力。 具體的研究?jī)?nèi)容如下： 1．用葉酸對(duì)第五代PMAMM (G5 PC-PAMAM) 載體進(jìn)行表面修飾，合成了G5 PC-PAMAM-FA 并對(duì)其進(jìn)行了表征。修飾后的載體對(duì)NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性較未修飾的載體略小，瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果表明當(dāng)載體與DNA的質(zhì)量比大于10∶1時(shí)，G5 PC-PAMAM-FA能夠完全阻滯DNA在瓊脂糖凝膠中的運(yùn)動(dòng)。載體與DNA形成復(fù)合物的粒徑穩(wěn)定在210mm左

4、右。當(dāng)質(zhì)量比=4∶1時(shí) G5PC-PAMAM-Tf/DNA 復(fù)合物的zeta電位穩(wěn)定在22 mv左右。系統(tǒng)的考察了在體外修飾后的載體介導(dǎo)EGFP基因轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG<,2>細(xì)胞的能力，結(jié)果表明偶聯(lián)葉酸后提高了原載體的轉(zhuǎn)染性能。通過(guò)比較修飾前后的載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異，初步檢驗(yàn)了修飾后載體對(duì)癌細(xì)胞具有了靶向性。 2．以G5 PC-PAMAM 為載體，通過(guò)二硫鍵共軛交聯(lián)的方法將轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)在載體表面上，分子篩層析

5、進(jìn)行純化分離，合成出具有癌細(xì)胞靶向的基因載體 G5PC-PAMAM-Tf。這種載體對(duì)NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性均遠(yuǎn)小于PEI和PLL。凝膠電泳的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)載體與DNA的質(zhì)量比>10∶1時(shí)，G5 PC-PAMAM-Tf能夠與DNA完全形成聚電解質(zhì)復(fù)合物。當(dāng)與DNA的質(zhì)量比>20∶1后，G5PC-PAMAM-Tf 載體與DNA形成復(fù)合物的粒徑穩(wěn)定在450nm左右。在質(zhì)量比=10∶1時(shí)G5 PC-PAMAM-Tf/DNA復(fù)合物的zeta電位