高效非病毒基因載體的構建及重組樹突狀細胞應用于腫瘤的免疫治療.pdf

1、目的:構建篩選高效非病毒基因轉染載體,用于攜載報告基因及目的基因轉染樹突狀細胞(DendriticCell,DC).通過理化性質和生物學手段評價非病毒轉染載體的轉染效率、安全性及轉染機制,并在小鼠模型上評價以基因轉染DC為疫苗預防黑色素瘤生成的效果。
　　 方法:1、合成和表征β-聚氨酯(Polyβ-aminoester,PBAE),殼聚糖-聚醚酰亞胺(Chitosan-Polyetherimide,CP)及精胺.右旋糖酐(Sp

2、ermine-Dextran,SD)三種非病毒基因轉染材料;2、孵育法制備非病毒基因轉染材料/DNA納米復合物,并對各種材料/DNA復合物進行表征,通過攜載蟲熒光素酶報告基因質?；蚓G熒光蛋白EGFP質粒等報告基因對腫瘤細胞株進行常規(guī)轉染;3、進一步利用上述制備的攜載有報告基因質粒的材料/DNA納米復合物轉染DC,利用流式細胞技術及熒光顯微成像技術考察納米復合物轉染效率、利用MTT法考察復合物細胞毒性,利用共聚焦顯微成像技術考察復合物入核

3、入胞情況,從而篩選出適于DC轉染的安全高效載體;4、利用上述材料/DNA復合物包裹腫瘤相關抗原基因及細胞性趨化因子受體基因共轉染DC,考察該DC疫苗免疫預防抑制小鼠黑色素實體瘤效果;5、利用所篩選的載體材料攜載腫瘤相關抗原基因及細胞性趨化因子受體基因轉染DC,利用Transwell方法考察基因重組DC體外游走遷移情況,并通過細胞示蹤結合載體熒光成像技術考察經轉染DC體內游走遷移情況.
　　 結果:成功合成PBAE、CP與SD等非

4、病毒基因轉染材料.通過孵育法成功制備PBAE,CP和SD的基因復合納米粒。TEM觀察表明SD/DNA復合物是結構均一類球形復合納米粒。通過攜載報告基因對細胞株進行轉染結果表明三種材料載體基因復合物對于腫瘤細胞株均有良好的轉染活性。熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡結果表明經三種非病毒載體攜載的DNA均能成功進入DC胞漿及細胞核。三種非病毒基因轉染材料攜載EGFP報告基因轉染實驗結果表明,與市售試劑Lipofectamine2000(Lipo)

5、/DNA復合物相比,CP與SD的基因復合納米粒對DC具有較佳轉染效率及生物安全性,對于后者,其入胞抑制實驗結果顯示SD/DNA在入胞抑制劑NaN3及MBCD存在下入胞量減少,證明其入胞途徑為能量依賴性的小窩-脂筏介導的內吞途徑.經SD攜載趨化性細胞因子受體CCR7質粒復合物轉染的DC在體外遷移實驗中較Lipo基因復合物轉染DC顯示出更高的遷移活性;進一步,在體內遷移實驗中亦顯示出更明顯的淋巴趨向歸巢現象。在exvivo實驗中,經SD攜載

6、的黑色素瘤抗原gp100質粒轉染的DC疫苗具有良好的免疫抑制黑色素實體瘤效果,而經CP攜載的gp100抗原質粒轉染的DC疫苗免疫抑瘤活性較差。進一步的DC疫苗免疫實驗中,經SD攜載抗原質粒gp100和CCR7質粒轉染的DC疫苗組產生了顯著的抑瘤效果并提高荷瘤小鼠生存率。
　　 結論:成功合成PBAE,CP與SD三種非病毒基因轉染材料,其對腫瘤細胞株具有高效安全的轉染效率。經篩選SD攜載的DNA納米復合物,對于DC具有良好的轉染活